Sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của một số dược liệu ở miền Trung Việt Nam

Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 5 - tháng 10/2018<br /> <br /> <br /> SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA<br /> MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Ở MIỀN TRUNG VIỆT NAM<br /> Nguyễn Đình Quỳnh Phú, Phạm Thị Hiền Thư, Nguyễn Thị Hoài<br /> Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế<br /> <br /> Tóm tắt<br /> Đặt vấn đề: Sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của 12 mẫu dược liệu được sử dụng theo<br /> kinh nghiệm dân gian để điều trị Gout hoặc các tác dụng liên quan như tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm<br /> và giảm đau. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các mẫu dược liệu được chiết siêu âm với dung môi<br /> methanol và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao dược liệu. Các cao toàn phần này<br /> được đánh giá khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro tại 3 nồng độ là 100, 50 và 10μg/ml dựa trên phương<br /> pháp đánh giá nồng độ acid uric tạo thành thông qua phương pháp đo quang của Tadataka Noro. Kết quả:<br /> Ở nồng độ 100μg/ml có 11 mẫu thể hiện hoạt tính ức chế xanthin oxidase, ở nồng độ 50μg/ml có 8 mẫu có<br /> hoạt tính ức chế xanthin oxidase và ở nồng độ 10μg/ml chỉ có 2 mẫu có hoạt tính ức chế xanthin oxidase. Hai<br /> mẫu có tác dụng ức chế xanthin oxidase trên 50% là cây Lá bỏng và Bình bát. Kết luận: Cao toàn phần Lá bỏng<br /> (Bryophyllum pinnatum (Lam.) Kurz. - Crassulaceae) và Bình bát (Annona glabra L. - Annonaceae) có khả năng<br /> ức chế xanthin oxidase với giá trị IC50 lần lượt là 59,42 và 70,92μg/ml.<br /> Từ khóa: Cây thuốc Việt Nam, Ức chế xanthin oxidase, Gout.<br /> <br /> Abstract<br /> SCREENING ON XANTHINE OXIDASE INHIBITORY ACTIVITY OF<br /> SOME VIETNAM MEDICINAL PLANTS<br /> Nguyen Dinh Quynh Phu, Pham Thi Hien Thu, Nguyen Thi Hoai<br /> Faculty of Pharmacy, Hue University of Medicine and Pharmacy, Hue University<br /> <br /> Background: Xanthine oxidase inhibitory activity was assayed from twelve species used for the<br /> treatment of gout and related activity such as antioxidant, anti-inflammatory and analgesic activity by<br /> indigenous people of Vietnam. Materials and method: The leaves of these plants were extracted with methanol<br /> solvent and then to test the xanthine oxidase inhibitory activity in vitro through the modified Tadataka Noro’s<br /> spectrophotometric method. Results: Of the 36 extracts assayed, 11 extracts demonstrated xanthine oxidase<br /> inhibitory activity at 100μg/ml, 8 extracts demonstrated xanthine oxidase inhibitory activity at 50μg/ml and 2<br /> extracts demonstrated xanthine oxidase inhibitory activity at 10μg/ml. The methanol extracts of Bryophyllum<br /> pinnatum and Annona glabra showed an inhibition greater than 50%. Conclusion: The methanol extracts of<br /> Bryophyllum pinnatum (Lam.) Kurz. (Crassulaceae) and Annona glabra L. (Annonaceae) presented xanthine<br /> oxidase inhibitory activity with IC50 values of 59.42 and 70.92μg/ml, respectively.<br /> Keywords: Vietnamese medicinal plants, Xanthine oxidase inhibitory activity, Gout.<br /> <br /> <br /> <br /> 1. Đặt vấn đề và mục tiêu dược lý của dịch chiết dược liệu là hướng tiếp cận và<br /> Gout là bệnh lý rối loạn chuyển hóa và gây ra phát triển thuốc mới đang thu hút sự quan tâm của<br /> những đợt viêm khớp cấp tái phát do sự lắng đọng nhiều nhà khoa học. Xanthin oxidase là enzym đóng<br /> của các tinh thể muối urat trong các khớp, nếu vai trò quan trọng trong con đường tạo thành acid<br /> không điều trị kịp thời sẽ gây ra nhiều biến chứng uric và ức chế enzym này là một trong những đích<br /> nguy hiểm cho người bệnh. Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh tác dụng dược lý quan trọng của các thuốc được sử<br /> Gout ngày càng gia tăng nhanh chóng ở nhiều nước dụng để điều trị Gout. Một số công bố về tác dụng<br /> trên thế giới và trở thành sức ép cho hệ thống chăm ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu ở<br /> sóc sức khỏe trong cộng đồng [6]. Sàng lọc tác dụng Việt Nam đã góp phần cho thấy tiềm năng phát triển<br /> <br /> - Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Hoài, email: hoai77@gmail.com<br /> - Ngày nhận bài: 3/6/2018; Ngày đồng ý đăng: 15/10/2018; Ngày xuất bản: 8/11/2018<br /> <br /> <br /> 91<br /> Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 5 - tháng 10/2018<br /> <br /> <br /> thuốc điều trị Gout từ nguồn dược liệu ở nước ta vòng 2 giờ, lặp lại 3 lần. Lọc các dịch chiết methanol<br /> [1], [2]. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện để thu được qua bông, gộp dịch lọc và cô quay thu hồi<br /> sàng lọc tác dụng hạ acid uric thông qua việc đánh dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao toàn<br /> giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phần tương ứng.<br /> dược liệu được thu hái ở miền Trung Việt Nam. - Chuẩn bị mẫu thử: cao toàn phần của từng mẫu<br /> nghiên cứu được hòa tan trong dung môi dimethyl<br /> 2. Đối tượng và phương pháp nghiên sulfoxid (DMSO) để được dung dịch gốc ở nồng độ<br /> cứu 7mg/1ml. Sau đó dung dịch gốc này được pha loãng<br /> 2.1. Đối tượng nghiên cứu bằng dung dịch đệm thành các nồng độ thích hợp để<br /> Nguyên liệu là lá của 12 dược liệu được thu hái thực hiện các phản ứng với enzym.<br /> tại tỉnh Quảng Trị và Thừa Thiên Huế, đã và đang - Tiến hành thí nghiệm: Hỗn hợp phản ứng<br /> dùng để phòng và chữa các bệnh liên quan đến được tiến hành trong ống nghiệm gồm: 1ml dung<br /> tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và giảm đau. dịch cần thử, 2,9ml dung dịch đệm phosphat (pH =<br /> Tên khoa học của các mẫu cây nghiên cứu đã được 7,5) và 100μl dung dịch xanthin oxidase 0,01U/ml<br /> ThS. Lê Tuấn Anh - Trung tâm Khoa học Công nghệ (được pha trong dung dịch đệm phosphat, pH = 7,5)<br /> Quảng Trị, Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung được ủ ở 25oC trong 15 phút. Sau đó thêm tiếp 2ml<br /> giám định. Các mẫu nghiên cứu sau khi thu hái được xanthin 150mM, ủ ở 25oC trong 30 phút. Dừng phản<br /> phơi sấy khô, xay thô và chiết siêu âm với methanol ứng bằng cách thêm 1ml acid hydrochloric 1N. Hỗn<br /> ở 40oC trong vòng 2 giờ, lặp lại 3 lần. Lọc các dịch hợp phản ứng sau cùng được đem đo độ hấp thụ<br /> chiết methanol thu được qua bông, gộp dịch lọc và bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 290nm. Song<br /> cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các song với mỗi mẫu chứng, mẫu đối chiếu, mẫu thử có<br /> cao toàn phần. một mẫu trắng của chứng, mẫu trắng của đối chiếu<br /> 2.2. Máy móc, thiết bị và hóa chất và mẫu trắng của thử.<br /> 2.2.1. Máy móc, thiết bị, dụng cụ Các mẫu trắng của mẫu thử, mẫu chứng, mẫu<br /> - Máy đo quang UV-Vis Jasco V630. đối chiếu được tiến hành tương tự như mẫu thử,<br /> - Bể chiết siêu âm Elmasonic S100H. mẫu chứng và mẫu đối chiếu nhưng thay đổi trình<br /> - Máy cô quay Yamato. tự cho enzym vào ống nghiệm (enzym được cho<br /> - Micropipet đầu một kênh và đa kênh với nhiều vào sau khi thêm acid hydrochloric 1N). Thí nghiệm<br /> thể tích khác nhau. được lặp lại 3 lần.<br /> 2.2.2. Hóa chất, dung môi Đánh giá ảnh hưởng của các cao toàn phần lên<br /> - Thuốc đối chiếu: Allopurinol (Sigma Aldrich). hoạt độ xanthin oxidase in vitro:<br /> - Cơ chất: Xanthin (Sigma Aldrich), enzym: - Tính % ức chế:<br /> Xanthin oxidase (5UI, Sigma Aldrich).<br /> (A-B) - (C-D)<br /> - Dung môi pha mẫu: Dimethylsulfoxid (Merck). % ức chế = X 100<br /> - Dung môi chiết xuất: Methanol (Merck). (A-B)<br /> - Hóa chất pha đệm: Na2HPO4, KH2PO4, HCl và Trong đó:<br /> NaOH (Merck). A: mật độ quang đo được của mẫu chứng (mẫu<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu không có dịch chiết của các mẫu thử).<br /> Nguyên tắc: Dựa trên phương pháp của Tadata- B: mật độ quang đo được của mẫu trắng của<br /> ka Noro và cộng sự (1983) có điều chỉnh để phù hợp mẫu chứng (enzym được cho vào sau khi thêm acid<br /> với điều kiện phòng thí nghiệm [7], [8]. Nguyên tắc hydrochloric 1N).<br /> định lượng dựa trên phản ứng sau: C: mật độ quang đo được của mẫu thử (mẫu có<br /> Xanthin oxidase dịch chiết ở các nồng độ khác nhau).<br /> Xanthin + O2 + H2O Acid uric + H2O2 D: mật độ quang đo được của mẫu trắng của<br /> mẫu thử (enzym được cho vào sau khi thêm acid<br /> Hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông hydrochloric 1N).<br /> qua lượng acid uric tạo thành được đo ở bước sóng Allopurinol được sử dụng là thuốc đối chiếu và<br /> 290nm ở 25oC. được thử ở các nồng độ 5; 2,5; 1; 0,5 và 0,1μg/ml.<br /> Cách tiến hành: - Xác định giá trị IC50 của dược liệu tiềm năng:<br /> - Chiết xuất tạo cao toàn phần: 12 mẫu nghiên Tác dụng ức chế xanthin oxidase của các dược<br /> cứu được chiết xuất tạo cao toàn phần theo quy liệu có tiềm năng được đánh giá theo trị số IC50 - là<br /> trình sau: Cân 5,0g bột thô, cho vào bình nón có nút giá trị nồng độ (tính toán theo lý thuyết) tại đó mẫu<br /> mài và chiết siêu âm với 20ml methanol ở 40oC trong thử ức chế 50% sự tạo thành acid uric trong hỗn hợp<br /> <br /> 92<br />  Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 5 - tháng 10/2018<br /> <br /> <br /> phản ứng so với mẫu chứng. 3. Kết quả<br /> Phương pháp xử lý số liệu 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin<br /> Các số liệu nghiên cứu được xử lý dựa vào phần oxidase in vitro của các cao toàn phần dược liệu<br /> mềm Excel. Giá trị % ức chế được biểu diễn dưới Sau khi thu hái và xử lý nguyên liệu thu được,<br /> dạng X ± SD (X: giá trị trung bình, SD: độ lệch chuẩn). 12 mẫu dược liệu được chiết siêu âm với dung môi<br /> Giá trị IC50 được tính toán dựa vào đồ thị và phương methanol thu được dịch chiết toàn phần, tiến hành<br /> trình biểu diễn nồng độ và giá trị ức chế enzym cô quay thu hồi dung môi thu được cao methanol<br /> xanthin oxidase của các cao toàn phần dược liệu toàn phần. Các cao toàn phần này được đánh giá tác<br /> tiềm năng. dụng ức chế xanthin oxidase ở 3 nồng độ 100, 50 và<br /> 10μg/ml. Kết quả được trình bày ở Bảng 1.<br /> Bảng 1. Khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của các cao toàn phần<br /> ở ba nồng độ khác nhau<br /> % ức chế<br /> STT Tên Việt Nam Tên khoa học<br /> 10 μg/ml 50 μg/ml 100 μg/ml<br /> Clausena excavata<br /> 1 Hồng bì dại _ _ 5,9 ± 0,5<br /> - Rutaceae<br /> Erythropalum scandens<br /> 2 Dây hương _ 27,6 ± 0,4 43,1 ± 0,3<br /> - Erythropalaceae<br /> Torenia benthamiana<br /> 3 Tô liên _ 5,6 ± 0,2 10,7 ± 0,5<br /> - Scrophulariaceae<br /> Schismatoglottis calyptrata<br /> 4 Đoạn thiệt nắp _ 13,7 ± 0,3 34,2 ± 0,4<br /> - Araceae<br /> Annona glabra<br /> 5 Bình bát 13,6 ± 1,0 42,3 ± 0,7 62,7 ± 0,9<br /> - Annonaceae<br /> Hedara helix<br /> 6 Thường xuân _ _ _<br /> - Araliaceae<br /> Derris ferruginea<br /> 7 Cóc kèn sét _ _ 12,6 ± 0,4<br /> - Fabaceae<br /> Olax imbricata<br /> 8 _ 18,3 ± 0,6 40,8 ± 0,1<br /> - Olacaceae<br /> Polygonum multiflorum<br /> 9 Rau răm _ 19,1 ± 0,3 44,7 ± 0,1<br /> - Polygonaceae<br /> Caesalpinia pulcherrima<br /> 10 Kim phượng _ 7,5 ± 0,3 33,0 ± 0,9<br /> - Fabaceae<br /> Bryophyllum pinnatum<br /> 11 Lá bỏng 20,3 ± 0,3 48,9 ± 1,0 77,5 ± 0,9<br /> - Crassulaceae<br /> Houttuynia cordata<br /> 12 Diếp cá _ _ 6,6 ± 0,4<br /> - Saururaceae<br /> Ghi chú: -: không xác định<br /> Dựa vào kết quả ở Bảng 1 cho thấy: tại nồng 3.2. Kết quả xác định giá trị IC50 của các dược<br /> độ 100μg/ml, có 11 mẫu thể hiện tác dụng ức chế liệu tiềm năng<br /> xanthin oxidase; tại nồng độ 50μg/ml có 8 mẫu có Sau khi đánh giá sơ bộ khả năng ức chế xanthin<br /> tác dụng và tại nồng độ 10μg/ml chỉ có 2 mẫu có khả oxidase in vitro, 2 mẫu có tác dụng ức chế xanthin<br /> năng ức chế xanthin oxidase. Hai mẫu có khả năng oxidase in vitro mạnh nhất là cây Lá bỏng (Bryophyllum<br /> ức chế xanthin oxidase in vitro trên 50% là cây Lá pinnatum (Lam.) Kurz. - Crassulaceae) và cây Bình bát<br /> bỏng và Bình bát nên được lựa chọn tiếp tục nghiên (Annona glabra L. - Annonaceae). Các mẫu này được<br /> cứu để xác định giá trị IC50. thiết lập dãy nồng độ khảo sát để xác định giá trị<br /> <br /> 93<br /> Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 5 - tháng 10/2018<br /> <br /> <br /> IC50. Đồ thị thể hiện khả năng ức chế enzym xanthin và thuốc đối chiếu Allopurinol ở các nồng độ khác<br /> oxidase in vitro của cao toàn phần Lá bỏng, Bình bát nhau được thể hiện ở Hình 1 và Hình 2.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao toàn phần Lá bỏng và Bình bát<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của Allopurinol<br /> Dựa vào đồ thị thiết lập được, tiến hành xác định giá trị IC50 của cao toàn phần cây Lá bỏng và Bình bát.<br /> Kết quả được trình bày trong Bảng 2.<br /> Bảng 2. Giá trị IC50 của cao toàn phần Lá bỏng và Bình bát<br /> STT Tên Việt Nam Tên khoa học IC50 (μg/ml)<br /> 1 Lá bỏng Bryophyllum pinnatum (Lam.) Kurz – Crassulaceae 59,42<br /> 2 Bình bát Annona glabra L. – Annonaceae 70,92<br /> 3 Allopurinol 0,28<br /> <br /> <br /> 4. Bàn luận về khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của hai<br /> Khả năng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro loài Lá bỏng và Bình bát. Một số nghiên cứu về có tác<br /> của cao toàn phần methanol từ 12 dược liệu được dụng chống oxy hóa, giảm đau và kháng viêm của<br /> thu hái tại tỉnh Thừa Thiên Huế và Quảng Trị đã dược liệu Lá bỏng đã được công bố [3], [4]. Các nhà<br /> được xác định. Trong nghiên cứu này, hai dược liệu khoa học cũng đã báo cáo về tác dụng giảm đau và<br /> thể hiện hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase khá gây độc tế bào của cây Bình bát [5], [9]. Đây là tiền<br /> tốt là cây Lá bỏng và Bình bát với giá trị IC50 lần lượt đề để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hai dược liệu<br /> là 59,42 và 70,92μg/ml. Đây là thông báo đầu tiên này. Mặc dù giá trị IC50 của cao toàn phần Lá bỏng<br /> <br /> 94<br />  Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 5 - tháng 10/2018<br /> <br /> <br /> và Bình bát cao gấp nhiều lần so với thuốc đối chiếu mẫu có tác dụng ức chế, tại nồng độ 50μg/ml có 8<br /> là chất chuẩn tinh khiết Allopurinol nhưng kết quả mẫu có tác dụng ức chế và tại nồng độ 10μg/ml chỉ<br /> của đề tài đã góp phần định hướng nguồn dược có 2 mẫu thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase<br /> liệu tiềm năng để làm cơ sở khoa học cho việc xúc in vitro.<br /> tiến các nghiên cứu xa hơn nhằm tìm kiếm các hợp Đã xác định được giá trị IC50 của 2 dược liệu có<br /> chất có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị bệnh Gout tiềm năng ức chế xanthin oxidase in vitro là cây Lá<br /> thông qua con đường ức chế xanthin oxidase. bỏng và Bình bát với giá trị IC50 lần lượt là 59,42 và<br /> 70,92μg/ml.<br /> 5. Kết luận Lời cảm ơn: Các tác giả trân trọng cảm ơn Quỹ<br /> Đã sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in nghiên cứu khoa học của Trường Đại học Y Dược - Đại<br /> vitro của 12 dược liệu: tại nồng độ 100μg/ml có 11 học Huế đã hỗ trợ kinh phí thực hiện công trình này.<br /> <br /> <br /> <br /> Tài liệu tham khảo<br /> <br /> <br /> <br /> 1. Hoàng Thị Thanh Thảo, Nguyễn Thùy Dương, 5. Biba V. S. et al. (2014), “Anticancer, antioxidant<br /> Nguyễn Hoàng Anh, Phạm Đức Vịnh, Nguyễn Thị Hoài, and antimicrobial activity of Annonaceae family”, World<br /> Nguyễn Quỳnh Chi (2013), “Sàng lọc các cây thuốc Việt Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(3),<br /> Nam có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro”, Tạp chí 1595-1604.<br /> Dược liệu, tập 18, số 6, 361-367. 6. Eggebeen AT (2007), “Gout: an update”, Am Fam<br /> 2. Nguyễn Thị Kim Thu, Đặng Kim Thu, Bùi Thanh Tùng Physician., 76(6), 801-808.<br /> (2017), “Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase 7. Muthuswamy Umamaheswari et al. (2007),<br /> in vitro của lá và vỏ rễ cây Dâu tằm (Morus alba L.)”, Tạp<br /> “Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian<br /> chí Dược học, số 491, 8-11.<br /> medicinal plants”, Journal of Ethnopharmacology, 109,<br /> 3. Abhishek Sharma et al. (2014), “In vitro antibacterial<br /> and antioxidant activity of Bryophyllum pinnatum 547-551.<br /> (Lam.) Kurz.”, International Journal of Pharmacy and 8. Noro T et al. (1983), “Inhibitors of xanthine oxidase<br /> Pharmaceutical Sciences, 6(1), 558-560. from flowers and buds of Daphne genkwa”, Chem. Pharm.<br /> 4. Anjoo Kamboj, Ajay Kumar Saluja (2009), Bull.”, 31, 3984-3987.<br /> “Bryophyllum pinnatum (Lam.) Kurz.: Phytochemical 9. Siebra et al. (2009), “Anti-inflammatory potential<br /> and pharmacological profile: A review”, Pharmacognosy of Annona glabra, Annonaceae”, Rev. Bras. Farmacogn.,<br /> Review, 3(6), 364-374. 19(1a), 82-88.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 95<br />