Sơ bộ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết từ hoàng liên giải độc thang

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> SƠ BỘ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT<br /> TỪ HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG<br /> Trần Thu Nga*, Nguyễn Phương Dung*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Hoàng liên giải độc thang (HLGĐ) là bài thuốc thanh nhiệt giải độc có<br /> xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương Đảo (Nhà Đường). Bài<br /> thuốc được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để điều trị một số bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết<br /> lỵ…. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái tháo đường, viêm<br /> đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, ung thư…. trên thực nghiệm. Để tiện lợi trong việc sử dụng bài<br /> thuốc trong nghiên cứu và điều trị, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết HLGĐ bằng phương pháp<br /> phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng<br /> Berberin -hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc.<br /> Đối tượng – phương pháp phương tiện nghiên cứu: Dược liệu được khoa Dược- Cơ sở 3 Bệnh viện Đại<br /> học Y Dược TP. HCM cung cấp. Áp dụng các phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật bằng các phản<br /> ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, xác định hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật quang phổ.<br /> Kết quả: Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và độ tro toàn phần trung bình là 8,46%. Xác định sự<br /> hiện diện alkaloid và flavonoid trong cao HLGĐ. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng xác định được cao HLGĐ có đủ 4<br /> dược liệu cấu thành bài thuốc. Hàm lượng Berberin trong cao là 0,852%.<br /> Kết luận: Việc dùng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, đồng thời xác định hàm lượng Berberin đã<br /> góp phần xây dụng tiêu chuẩn cơ sở cao HLGĐ.<br /> Từ khóa: Hoàng liên giải độc thang, tiêu chuẩn hoá, sắc ký lớp mỏng<br /> <br /> ABSTRACT<br /> PRELIMINARY CONSTRUCTION OF BASIC STANDARD FOR<br /> “HUANG LIAN JIE DU TANG” EXTRACT<br /> Tran Thu Nga, Nguyen Phuong Dung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 203 - 208<br /> Background- Objectives: Huang lian jie du tang (HLJDT) is a traditional remedy originated from China,<br /> that was commented in Ngoai dai bi yeu by Vuong Dao. It is used widely to treat some infectious diseases such as<br /> pneumonia, furuncles, dysentery…Many studies have demonstrated that HLJDT is effective in treating diabetes,<br /> enteritis, Alzheimer, atherosclerosis, cancer on experimentation. In order to make HLJDT more convenient in<br /> research and treatment, we establish the basic standards of HLJDT extract by applying the chemical reaction<br /> method associated with thin layer chromatography fingerprints method for qualitative determination. As well,<br /> berberin - an alkaloid – main active compound of the remedy- was determined.<br /> Methods: Crude drugs of HLJDT remedy were supplied by Pharmaceutical Ward of University Medical<br /> Center HoChiMinh City. Chemical reactions and TLC- fingerprints were used as method for determining the<br /> chemical components. Berberin was determined by means of the spectral methods.<br /> <br /> ∗ Khoa YHCT, Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh<br /> Địa chỉ liên hệ: Bs. Trần Thu Nga<br /> ĐT: 0989231241<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Email: thunga149@yahoo.com<br /> <br /> 203<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Results: The average humidity of HLJDT is 31.91% and the average complete ash-content is 8.46%. There<br /> are alkaloid and flavonoid in the product. TLC of HLJDT extract revealed all four crude drugs. Berberin<br /> concentration in the product is 0.852%.<br /> Conclusion: It could be applied chemical reaction method, thin layer chromatography fingerprints method<br /> and berberin determination to standardize the HLJDT extract.<br /> Keywords: Huang lian jie du tang, standardization, thin layer chromatography.<br /> định về kiểm tra chất lượng thuốc của Dược<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> điển Việt Nam 4.<br /> Hoàng liên giải độc thang (gồm 4 vị thuốc:<br /> Phương pháp<br /> Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix<br /> Điều chế cao chiết bài thuốc.<br /> Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và<br /> Chi tử (Fructus Gardeniae)) là bài thuốc cổ<br /> Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp sắc<br /> phương có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Bài<br /> trong dung môi nước. Sau khi thu được dịch<br /> thuốc có xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong<br /> chiết, tiến hành lọc và cô cách thủy để thu được<br /> tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương<br /> cao HLGĐ.<br /> (1)<br /> Đảo (Nhà Đường) . Công dụng bài thuốc được<br /> Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết bài<br /> ghi trên một số tài liệu ứng dụng điều trị một số<br /> thuốc(2).<br /> bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết<br /> Độ ẩm<br /> lỵ…(1, 7). Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng<br /> Cân chính xác khoảng 0,5 g cao vào một<br /> minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái<br /> chén<br /> cân, đem sấy ở 1050C trong tủ sấy dưới<br /> tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer,<br /> áp suất thường đến khối lượng không đổi.<br /> xơ vữa động mạch…trên thực nghiệm (3,5,8,9). Một<br /> Tính độ ẩm:<br /> nghiên cứu gần đây kết luận tác dụng bài thuốc<br /> gây ra sự chết theo chương trình và sự ngừng<br /> chu kỳ tế bào ở dòng tế bào ung thư gan in vitro<br /> và in vivo (4).. Ngoài ra, trên mô hình gây độc<br /> bằng cyclophosphamid, cao chiết Hoàng liên giải<br /> độc thang đã cho thấy có tác dụng bảo vệ gan,<br /> chống oxy hóa, giải độc (6). Để thuận lợi cho việc<br /> nghiên cứu và sử dụng bài thuốc trong điều trị,<br /> chúng tôi áp dụng phương pháp phân tích hóa<br /> học kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và<br /> định lượng hoạt chất berberin chính trong cao<br /> HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết<br /> bài thuốc.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nguyên liệu<br /> Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma<br /> Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae),<br /> Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và Chi tử<br /> (Fructus Gardeniae) được cung cấp bởi khoa<br /> Dược- Cơ sở 3- Bệnh viện Đại học Y Dược TP.<br /> HCM. Mỗi dược liệu được chuẩn hoá theo quy<br /> <br /> 204<br /> <br /> H% =<br /> <br /> a−b<br /> × 100<br /> a<br /> <br /> a: khối lượng bột dược liệu trước khi sấy (g); b: khối lượng<br /> bột dược liệu sau khi sấy (g); H%: độ ẩm (kl/kl)<br /> <br /> Độ tro toàn phần<br /> Cân chính xác khoảng 0,5 g cao cho vào chén<br /> nung. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn<br /> thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy<br /> hoàn toàn và chén không còn bốc khói.<br /> Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở<br /> 500- 600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro<br /> không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén<br /> nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút<br /> ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.<br /> Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp<br /> tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy<br /> chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình<br /> hút ẩm. Cân.<br /> Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần<br /> cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> lệch không quá 0,5 mg. Tro toàn phần tính trên<br /> dược liệu khô kiệt theo công thức:<br /> <br /> A=<br /> <br /> (a − b )× 100 %<br /> c − (c × h )<br /> <br /> A%: tro toàn phần (%) của dược liệu; a: khối lượng chén có<br /> tro; b: khối lượng chén không; c: khối lượng dược liệu dùng;<br /> h: độ ẩm (%) của dược liệu<br /> <br /> Định tính<br /> Phương pháp hóa học:<br /> Hợp chất alkaloid:<br /> Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với<br /> H2SO4 5% (3lần x 5ml), lọc qua giấy lọc, dịch lọc<br /> H2SO4 5% chia vào 3 ống nghiệm để làm phản<br /> ứng với TT Mayer, Dragendroff, Bouchardat và<br /> quan sát màu của ống nghiệm sau phản ứng.<br /> Hợp chất flavonoid:<br /> Lấy 1 g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml<br /> MeOH, lọc. Dịch lọc được cô đến cắn. Hoà cắn<br /> với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc.<br /> Dịch lọc chia vào 3 ống nghiệm làm phản ứng<br /> với NaOH 10%, FeCl3 3% trong cồn và thuốc thử<br /> chì acetat. Quan sát màu của ống nghiệm sau<br /> phản ứng chứng minh flavonoid (+): phản ứng<br /> với NaOH 10% cho dung dịch màu cam, phản<br /> ứng với FeCl3 3% cho dung dịch màu xanh đậm<br /> và với thuốc thử chì acetat cho dung dịch, màu<br /> trắng đục.<br /> Phương pháp sắc kí lớp mỏng:<br /> Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản<br /> mỏng tráng sẵn Silicagel 60F254 (Merck). Lấy<br /> khoảng 0,1 g mỗi dược liệu, cho vào cốc có mỏ<br /> 50 ml, thêm vào 10ml MeOH, siêu âm 15 phút,<br /> lọc. Tập trung lọc cô còn 1ml làm dung dịch<br /> chấm sắc ký, so sánh với dịch chiết dược liệu<br /> làm đối chiếu trên sắc ký lớp mỏng với các hệ<br /> dung môi tương thích được tham khảo trong<br /> các dược điển.<br /> <br /> Định lượng<br /> Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ được<br /> xác định dựa vào đường cong chuẩn độ của<br /> berberin chuẩn trong methanol trên máy quang<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic<br /> HEλIOS.<br /> Xác định đỉnh hấp thu cực đại:<br /> Đỉnh hấp thu cực đại của berberin chuẩn<br /> trong methanol là λmax = 266 nm.<br /> Xây đựng đường chuẩn berberin.<br /> Thiết lập giai mẫu<br /> Cân chính xác 2 mg berberin chuẩn, hòa tan<br /> trong 10 ml methanol và cho vào bình định mức<br /> 10 ml (dung dịch chuẩn A). Dùng micro pipette<br /> lấy chính xác dung dịch chuẩn A có thể tích lần<br /> lượt là: 150 µl, 200 µl, 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400<br /> µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol<br /> tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy<br /> quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic<br /> HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm.<br /> Mẫu thử<br /> Cân chính xác khoảng 100 mg cao, cho vào<br /> bình nón có dung tích 100 ml, chiết siêu âm<br /> nhiều lần bằng methanol cho đến khi dịch chiết<br /> methanol không còn phản ứng của chất berberin.<br /> Dịch chiết cô còn khoảng 10 ml và cho vào bình<br /> định mức 10 ml, lắc đều. Dùng micro pipet hút<br /> chính xác 500 µl dịch chiết cho vào bình định<br /> mức 10 ml và thêm methanol tới vạch, lắc đều,<br /> tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử<br /> ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại<br /> đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm.<br /> Bảng 1. Mật độ quang của giai mẫu berberin chuẩn.<br /> Bình định mức<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> <br /> Hàm lượng<br /> berberin (µg/ml)<br /> 3 µg<br /> 4 µg<br /> 5 µg<br /> 6 µg<br /> 7 µg<br /> 8 µg<br /> <br /> Mật độ quang<br /> (OD)<br /> 0,262<br /> 0,340<br /> 0,421<br /> 0,491<br /> 0,566<br /> 0,636<br /> <br /> Công thức tính hàm lượng berberin trong<br /> mẫu thử: dựa vào đường chuẩn y= 0,0748x +<br /> 0,0413.<br /> <br /> C(%) =<br /> <br /> At − 0,0413 100 b<br /> ×<br /> × ×10−6<br /> 0,0748<br /> 0,5 p<br /> <br /> 205<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> A t: Độ hấp thu của mẫu thử. b: Khối lượng 100 g<br /> cao HLGĐT khô kiệt (g). p: Khối lượng cao<br /> <br /> HLGĐT đem thử đã trừ ẩm (g).<br /> <br /> y = 0,0748x + 0,0413<br /> <br /> Đường chuẩn BERBERIN<br /> <br /> R 2= 0,9994<br /> <br /> 0.7<br /> 0.6<br /> 0.5<br /> 0.4<br /> 0.3<br /> 0.2<br /> 0.1<br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8<br /> <br /> 10<br /> <br /> HÀM LƯỢNG (µg/ ml)<br /> Biểu đồ 1. Đường chuẩn của dung dịch chuẩn berberin.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Bào chế cao HLGĐ.<br /> 80 0C -1000C<br /> 10 lít nước<br /> 60 phút<br /> <br /> Dược liệu<br /> 2440 g<br /> <br /> Dịch chiết 1<br /> 2500 ml nước<br /> <br /> Bã dược liệu<br /> 800C-1000C<br /> 5000 ml nước<br /> 30 phút<br /> Dịch chiết 2<br /> 1200 ml<br /> <br /> Dịch chiết 1+2<br /> Lọc<br /> Cô cách thủy<br /> Cao HLGĐ (650g)<br /> Sơ đồ 1. Qui trình bào chế cao HLGĐ<br /> Hiệu suất chiết cao: 18,13%<br /> <br /> 206<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> Độ ẩm cao HLGĐ<br /> <br /> Cao<br /> Khối lượng Cao HLGĐT (g)<br /> Tro toàn phần (%)<br /> Trung bình (%)<br /> <br /> Bảng 2. Độ ẩm của cao HLGĐ.<br /> Cao<br /> Khối lượng Cao HLGĐT(g)<br /> Độ ẩm (%)<br /> Trung bình (%)<br /> <br /> Lần 1<br /> 0,5183<br /> 32,22<br /> <br /> Lần 2 Lần 3<br /> 0,4998 0,5078<br /> 31,63 31,88<br /> 31,91<br /> <br /> Tro toàn phần cao HLGĐ<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Lần 1 Lần 2 Lần 3<br /> 0,5254 0,5512 0,5390<br /> 8,36 8,31 8,72<br /> 8,46<br /> <br /> Định tính<br /> - Phương pháp hóa học: Hợp chất flavonoid<br /> và alkaloid: dương tính.<br /> - Phương pháp sắc kí lớp mỏng:<br /> <br /> Bảng 3. Độ tro toàn phần của cao HLGĐ.<br /> Bảng 4. Sắc ký đồ của cao HLGĐ so với nguyên liệu đối chiếu.<br /> Nguyên liệu<br /> Hoàng liên<br /> <br /> Hoàng bá<br /> <br /> Hoàng cầm<br /> <br /> Chi tử<br /> <br /> Hệ dung môi khai triển<br /> <br /> Số vết của nguyên Số vết Số vết trùng giữa<br /> liệu đối chiếu của cao nguyên liệu với cao<br /> <br /> Phát hiện<br /> <br /> n-butanol:acid<br /> Phun TT Dragendorff và quan<br /> sát dưới ánh sáng thường và<br /> acetic:nước<br /> đèn UV λ= 366 nm<br /> (7 : 1 : 2)<br /> n-butanol:acid<br /> Phun TT Dragendorff và quan<br /> sát dưới ánh sáng thường và<br /> acetic:nước<br /> đèn UV λ= 366 nm<br /> (7 : 1 : 2)<br /> Toluen : ethyl<br /> Phun FeCl3 và quan sát dưới<br /> ánh sáng thường và đèn UV<br /> acetat : acid formic<br /> λ= 366 nm<br /> (2 : 3 : 2.2)<br /> Ethyl acetat : aceton :<br /> Phun H2SO4 quan sát dưới<br /> ánh sang thường và đèn UV<br /> acid formic : nước<br /> λ=366nm<br /> (5 : 5 : 1 : 1)<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> Kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã<br /> chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có<br /> sự hiện diện của các dược liệu: Hoàng liên,<br /> Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử. Chứng tỏ phương<br /> pháp chiết xuất giữ được các thành phần chủ<br /> yếu của công thức cổ truyền.<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu hàm lượng berberin<br /> trong cao HLGĐ thu được là 0,852 % chiếm tỷ lệ<br /> 62,29 % - 84,35 % so với hàm lượng berberin dự<br /> đoán. Như vậy, kết quả định lượng cao HLGĐ<br /> cho thấy phương pháp chiết xuất thu được gần<br /> hết thành phần alkaloid có trong dược liệu.<br /> <br /> Định lượng<br /> <br /> Cao HLGĐ đã được xây dựng tiêu chuẩn<br /> chất lượng về độ ẩm (Bảng 2), độ tro toàn phần<br /> (Bảng 3), hàm lượng berberin (Bảng 5) cho phép<br /> đánh giá tính ổn định của chế phẩm, bảo đảm<br /> tính chính xác của các kết quả mà nghiên cứu<br /> thu được. Qui trình bào chế cao HLGĐ (Sơ đồ 1)<br /> đơn giản, có hiệu quả, dễ thực hiện và dễ ứng<br /> dụng trong sản xuất sau này.<br /> <br /> Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ.<br /> Bảng 5. Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ.<br /> Khối lượng Khối lượng<br /> Hàm lượng<br /> Mật độ<br /> STT Mẫu chưa Mẫu thử đã<br /> berberin trong cao<br /> quang<br /> trừ ẩm (g) trừ ẩm (g)<br /> HLGĐT khô kiệt (%)<br /> 1<br /> 0,1178<br /> 0,0802<br /> 0,282<br /> 0,802<br /> 2<br /> 0,1073<br /> 0.0730<br /> 0,276<br /> 0,858<br /> 3<br /> 0,1187<br /> 0.0808<br /> 0,312<br /> 0,895<br /> Trung bình<br /> 0,852<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Kết quả định tính bằng phương pháp hóa<br /> học cho thấy cao HLGĐ có hiện diện hợp chất<br /> flavonoid, alkaloid và kết quả sắc ký lớp mỏng<br /> (Bảng 4) có sự hiện diện của cả 4 dược liệu cấu<br /> thành bài thuốc giúp khẳng định phương pháp<br /> chiết xuất có hiệu quả.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và<br /> độ tro toàn phần trung bình là 8,46%.<br /> Định tính bằng phương pháp hóa học cho<br /> thấy cao HLGĐ có sự hiện diện của hợp chất<br /> flavonoid và alkaloid. Trên sắc kí đồ của cao<br /> HLGĐ xác định sự hiện diện của 4 dược liệu:<br /> Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử.<br /> <br /> 207<br /> <br />