T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br />
<br />
SO SÁNH HIỆU QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN KỊ KHÍ CỦA<br />
BỐN PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI KHUẨN KỊ KHÍ<br />
TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT ĐỨC.<br />
Nguyễn Thị Vân*; Nguyễn Thái Sơn**; Kiều Chí Thành**<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: so sánh hiệu quả phân lập vi khuẩn (VK) kị khí của 4 phương pháp nuôi cấy VK kị<br />
khí hiện nay tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức. Phương pháp: nghiên cứu mô tả tiến cứu. Kết<br />
quả: tỷ lệ mọc VK kị khí bằng phương pháp sử dụng hệ thống Whitley anaerobic Workstations<br />
26,1%, phương pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa học 14,2%, phương pháp dùng túi<br />
Genbag anaer 13,0% và phương pháp dùng hệ thống ANOXOMAT 12,1%. Tỷ lệ mọc VK kị khí<br />
của phương pháp sử dụng hệ thống Whitley anaerobic Workstations cao hơn 2,14 lần phương<br />
pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa học (OR: 2,14; 95%CI: 1,37 - 3,32); 2,36 lần phương<br />
pháp dùng túi Genbag anaer (OR: 2,36; 95%CI: 1,50 - 3,72) và 2,56 lần phương pháp dùng hệ<br />
thống ANOXOMAT (OR: 2,56; 95%CI: 1,62 - 4,07). Kết luận: hệ thống Whitley anaerobic<br />
Workstations cho tỷ lệ phân lập VK kị khí cao hơn so với ba phương pháp còn lại.<br />
* Từ khóa: Vi khuẩn kị khí; Phân lập; Phương pháp nuôi cấy.<br />
<br />
Comparison of the Efficiency of Four Current Anaerobic Culture<br />
Methods in Vietduc Hospital<br />
Summary<br />
Objectives: To compare the efficiency of 4 different current methods on anaerobic culture in<br />
Vietduc Hospital. Methods: Prospective descriptive study. Results: The anaerobic growth rate of<br />
Whitley anaerobic Workstations method was 26.1%; the method creating atmosphere by<br />
chemical reactions was 14.2%; the method using Genbag anaer was 13.0% and the method<br />
using ANOXOMAT system was 12.1%. The microbial growth rate of Whitley anaerobic<br />
Workstations method was 2.14 times more than that of the chemical reaction-based method<br />
(OR: 2.14; 95%CI: 1.37 - 3.32); 2.36 fold higher than Genbag anaer method (OR: 2.36; 95%CI:<br />
1.50 - 3.72) and 2.56 times greater than ANOXOMAT method (OR: 2.56; 95%CI: 1.62 - 4.07).<br />
Conclusion: Whitley anaerobic Workstations method has the highest anaerobic growth rate in<br />
comparison with the other three methods.<br />
* Key words: Anaerobe; Isolation; Culture method.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Hiện nay, việc nuôi cấy VK kị khí trong<br />
các phòng xét nghiệm còn hạn chế do chi<br />
phí cao, kỹ thuật phức tạp. Với tỷ lệ nhiễm<br />
<br />
khuẩn không nhỏ do VK kị khí, hậu quả<br />
nghiêm trọng và tình hình kháng kháng<br />
sinh ngày càng gia tăng, nuôi cấy VK kị<br />
khí phải là một xét nghiệm thường quy<br />
trong phòng xét nghiệm vi sinh [3, 6].<br />
<br />
* Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức<br />
** Bệnh viện Quân y 103<br />
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Vân (dchkc76v@gmail.com)<br />
Ngày nhận bài: 10/02/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/04/2017<br />
Ngày bài báo được đăng: 22/05/2017<br />
<br />
130<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br />
Hiện nay, 4 phương pháp tạo khí trường<br />
kị khí được ứng dụng tại Bệnh viện Hữu<br />
Nghị Việt Đức: phương pháp tạo khí<br />
trường bằng phản ứng hóa học; phương<br />
pháp dùng túi Genbag anaer (BioMerieux),<br />
phương pháp tạo khí trường bằng hệ<br />
thống ANOXOMAT (Đức) và gần đây là<br />
phương pháp sử dụng hệ thống Whitley<br />
anaerobic Workstations (Anh) khép kín.<br />
Các cơ sở mới bắt đầu tìm hiểu hoặc<br />
chuẩn bị triển khai nuôi cấy VK kị khí<br />
thường lúng túng trong việc chọn phương<br />
pháp và thiết bị phù hợp. Để góp phần hỗ<br />
trợ và cung cấp thông tin cho các cơ sở<br />
triển khai nuôi cấy VK kị khí, chúng tôi<br />
tiến hành nghiên cứu đề tài này với mục<br />
tiêu: So sánh hiệu quả phân lập VK kị khí<br />
của 4 phương pháp nuôi cấy VK kị khí<br />
đang được ứng dụng tại Bệnh viện Hữu<br />
nghị Việt Đức.<br />
<br />
- Các chất hóa học cần thiết để tạo khí<br />
trường: 5 - 10% CO2, 5 - 10% H2, 80% N2<br />
như: axít sulphuric, axít citric, kẽm, nước<br />
và chất xúc tác.<br />
<br />
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
<br />
+ Vận chuyển bệnh phẩm: bệnh phẩm<br />
sau khi lấy được chuyển ngay đến khoa<br />
vi sinh sớm nhất có thể, trong vòng 60<br />
phút nếu vận chuyển bệnh phẩm bằng xi<br />
lanh, nếu vận chuyển bệnh phẩm trong<br />
môi trường chuyên dụng như BAYK, thời<br />
gian vận chuyển không quá 24 giờ.<br />
<br />
1. Đối tượng nghiên cứu.<br />
Các loại bệnh phẩm mủ lấy tại ổ áp xe<br />
gan, não, thận... và bệnh phẩm dịch ổ<br />
bụng do nhiễm trùng ổ bụng có biến<br />
chứng như: viêm phúc mạc ruột thừa,<br />
thấm mật phúc mạc.<br />
2. Vật tư và trang thiết bị nghiên<br />
cứu.<br />
- Môi trường nuôi cấy: canh thang,<br />
thạch máu, thạch Mac-conkey (Hãng<br />
Oxoid), thạch máu Columbia, vitamin K,<br />
hemin (Hãng BD).<br />
<br />
- Hệ thống ANOXOMAT (Đức) và bình<br />
nuôi cấy kị khí đồng bộ với hệ thống này.<br />
- Hệ thống Whitley anaerobic Workstations;<br />
model: DG250 (Anh Quốc).<br />
- Bình khí trộn gồm: 10% CO2, 10% H2,<br />
80% N2.<br />
3. Phương pháp nghiên cứu.<br />
Nghiên cứu mô tả tiến cứu.<br />
* Kỹ thuật tiến hành:<br />
- Lấy và vận chuyển bệnh phẩm:<br />
+ Mẫu bệnh phẩm: mủ hoặc dịch ổ<br />
bụng.<br />
+ Lượng bệnh phẩm: yêu cầu lấy ít<br />
nhất 2 ml (tốt nhất 5 - 10 ml) bệnh phẩm.<br />
<br />
- Các bước tiến hành nuôi cấy định<br />
danh tìm VK kị khí:<br />
+ Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm mủ, dịch ổ<br />
bụng đồng thời bằng 4 phương pháp<br />
khác nhau. Sau đó tiến hành phân lập,<br />
định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ<br />
với các loại VK kị khí phân lập được:<br />
<br />
- Các kít định danh: RAPID ID 32 A<br />
cùng phần mềm đọc định danh VK và túi<br />
Genbag anaer (Hãng Bio-Merieux).<br />
<br />
. Phương pháp 1: nuôi cấy bằng bình<br />
MART dung tích 5 lít, có nắp và gioăng<br />
cao su để vặn chặt nắp, tạo khí trường<br />
bằng các phản ứng hóa học [1, 2, 3, 4].<br />
<br />
- Khoanh giấy và thanh giấy kháng<br />
sinh (Hãng Bio-Merieux).<br />
<br />
. Phương pháp 2: nuôi cấy dùng túi<br />
Genbag anaer (Hãng Bio Merieux). Chất<br />
131<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br />
liệu túi là plastic, dung tích 1 lít, có ghim<br />
chặt miệng túi, khí trường được tạo ra<br />
bằng túi hóa chất đóng sẵn [3, 5].<br />
<br />
của bình được tạo ra bởi các phản ứng<br />
hóa học.<br />
<br />
. Phương pháp 3: nuôi cấy bằng bình<br />
MART, khí trường từ bình khí trộn (10%<br />
CO2, 10% H2 và 80% N2) đưa vào bình<br />
nuôi cấy qua hệ thống ANOXOMAT (Đức)<br />
[2, 5].<br />
<br />
- Cho ngay 1 đĩa thạch kị khí vào bình<br />
nuôi cấy MART: khí trường kị khí của<br />
bình được đưa vào từ bình khí trộn bởi<br />
hệ thống ANOXOMAT.<br />
<br />
. Phương pháp 4: nuôi cấy bằng hệ<br />
thống Whitley anaerobic Workstations,<br />
model: DG250 (Anh Quốc); tủ ấm kín,<br />
dung tích 79,6 lít, có vỏ chất liệu acrylic<br />
trong suốt, qua găng tay có thể thao tác<br />
xử lý mẫu ngay trong tủ, khí trường được<br />
đưa vào từ bình khí trộn (10% CO2, 10%<br />
H2 và 80% N2) bằng hệ thống tự động. Có<br />
bảng điện từ theo dõi nhiệt độ và nồng độ<br />
khí trong tủ [3, 4, 5, 6].<br />
* Các bước nuôi cấy VK kị khí:<br />
<br />
- 1 đĩa thạch kị khí cho vào túi genbag.<br />
<br />
- 1 đĩa thạch kị khí cho vào tủ cấy kị<br />
khí Whitley anaerobic Workstations.<br />
- Nuôi cấy VK ái khí đồng thời: ủ ấm<br />
đĩa thạch máu thường, đĩa thạch<br />
Macconkey trong khí trường bình thường<br />
của tủ ấm 370C.<br />
- Định danh VK kị khí tìm được: sau<br />
khi đã xác định được VK kị khí, tiến hành<br />
định danh VK đó bằng kít định danh ID 32<br />
A (Hãng Bio Merieux).<br />
* Phân tích và xử lý dữ liệu:<br />
<br />
- Bệnh phẩm được cấy đồng thời 4 đĩa<br />
thạch kị khí (trong 1 lít thạch Columbia có<br />
50 ml máu cừu, 2,5 mg haemin và 1 mg<br />
vitamin K) theo phương pháp phân vùng<br />
và 1 đĩa thạch máu thường, 1 đĩa thạch<br />
Maccokey [5].<br />
<br />
Nhập và làm sạch dữ liệu bằng phần<br />
mềm Epidata 3.1, sau đó xử lý trên phần<br />
mềm STATA 12.0. Trình bày thống kê mô<br />
tả dưới dạng tần số (n) và tỷ lệ phần trăm<br />
(%). Phân tích hồi quy logistic đơn biến<br />
để xác định mối tương quan giữa các<br />
phương pháp nuôi cấy.<br />
<br />
- Cho ngay 1 đĩa thạch kị khí vào<br />
bình nuôi cấy MART: khí trường kị khí<br />
<br />
Các phép kiểm định, so sánh có ý<br />
nghĩa thống kê khi p < 0,05.<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br />
Bảng 1: Phân bố bệnh phẩm mủ và dịch khi sử dụng 4 phương pháp nuôi cấy.<br />
Bệnh phẩm<br />
<br />
Phương pháp 1<br />
<br />
Phương pháp 2<br />
<br />
Phương pháp 3<br />
<br />
Phương pháp 4<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
Mủ các loại<br />
<br />
188<br />
<br />
55,5<br />
<br />
188<br />
<br />
55,5<br />
<br />
188<br />
<br />
55,5<br />
<br />
118<br />
<br />
49,6<br />
<br />
Dịch các loại<br />
<br />
151<br />
<br />
44,5<br />
<br />
151<br />
<br />
44,5<br />
<br />
151<br />
<br />
44,5<br />
<br />
120<br />
<br />
50,4<br />
<br />
339<br />
<br />
100<br />
<br />
339<br />
<br />
100<br />
<br />
339<br />
<br />
100<br />
<br />
238<br />
<br />
100<br />
<br />
Tổng<br />
<br />
Tỷ lệ mẫu bệnh phẩm mủ, dịch ở các phương pháp 1, 2, 3 (phương pháp tạo khí<br />
trường bằng phản ứng hóa học, phương pháp sử dụng túi genbag và phương pháp sử<br />
dụng hệ thống ANOXOMAT) như nhau. Phương pháp 4 (sử dụng hệ thống Whitley<br />
132<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br />
anaerobic Workstations), số bệnh phẩm mủ và dịch được nuôi cấy ít hơn. Sự khác<br />
nhau này là do nghiên cứu được chia 2 giai đoạn, kinh phí không đủ để thực hiện song<br />
song 4 phương pháp. Tuy nhiên, đối tượng nghiên cứu là VK kị khí có mặt trong các<br />
mẫu bệnh phẩm mủ và dịch, nên không có sự thay đổi đáng kể về tính chất sinh học<br />
của VK sau 1 năm. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả nuôi cấy VK kị khí khi sử dụng các<br />
phương pháp khác nhau bằng những yếu tố tỷ lệ mọc VK và tỷ lệ các loại VK kị khí<br />
mọc được.<br />
Bảng 2: So sánh khả năng mọc VK kị khí của 4 phương pháp.<br />
Bệnh phẩm<br />
<br />
Bệnh phẩm mọc VK kị khí<br />
<br />
Bệnh phẩm không mọc VK kị khí<br />
<br />
Số lượng<br />
<br />
Tỷ lệ (%)<br />
<br />
Số lượng<br />
<br />
Tỷ lệ (%)<br />
<br />
Phương pháp 4<br />
<br />
62<br />
<br />
26,1<br />
<br />
176<br />
<br />
73,9<br />
<br />
Phương pháp 1<br />
<br />
48<br />
<br />
14,2<br />
<br />
291<br />
<br />
85,8<br />
<br />
Phương pháp 4<br />
<br />
62<br />
<br />
26,1<br />
<br />
176<br />
<br />
73,9<br />
<br />
Phương pháp 2<br />
<br />
44<br />
<br />
13,0<br />
<br />
295<br />
<br />
87,0<br />
<br />
Phương pháp 4<br />
<br />
62<br />
<br />
26,1<br />
<br />
176<br />
<br />
73,9<br />
<br />
Phương pháp 3<br />
<br />
41<br />
<br />
12,1<br />
<br />
298<br />
<br />
87,9<br />
<br />
So sánh phương pháp 4 (hệ thống<br />
Whitley anaerobic Workstations) với từng<br />
phương pháp còn lại thấy: tỷ lệ mọc VK kị<br />
khí ở phương pháp 4 là 26,1%. Trong đó,<br />
tỷ lệ mọc ở phương pháp 1, 2, 3 (phương<br />
pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa<br />
học, phương pháp sử dụng túi genbag và<br />
phương pháp sử dụng hệ thống<br />
ANOXOMAT) lần lượt là 14,2%; 13,0% và<br />
12,1%. So sánh tỷ lệ mọc giữa phương<br />
pháp 4 và 3 với hai phương pháp còn lại<br />
thấy, tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp<br />
4 cao hơn 2,14 lần so với phương pháp 1<br />
<br />
OR<br />
(95%CI)<br />
2,14<br />
1,37 - 3,32<br />
2,36<br />
1,50 - 3,72<br />
2,56<br />
1,62 - 4,07<br />
<br />
(OR: 2,14; 95%CI: 1,37 - 3,32). Tỷ lệ mọc<br />
VK kị khí ở phương pháp 4 cao hơn 2,36<br />
lần tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp 2<br />
(OR: 2,36; 95%CI: 1,50 - 3,72); tỷ lệ mọc<br />
VK kị khí ở phương pháp 4 cao hơn 2,56<br />
lần tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp 3<br />
(OR: 2,56; 95%CI: 1,62 - 4,07). Khác biệt<br />
có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).<br />
Như vậy, tổng số mẫu nuôi cấy bằng<br />
phương pháp 4 (hệ thống Whitley<br />
anaerobic Workstations) ít hơn phương<br />
pháp 1, 2, 3 nhưng tỷ lệ mẫu bệnh phẩm<br />
mọc VK kị khí lại cao hơn.<br />
<br />
Bảng 3: Các chủng VK kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm mủ, dịch.<br />
VK kị khí<br />
<br />
Phương pháp 1<br />
<br />
Phương pháp 2<br />
<br />
Phương pháp 3<br />
<br />
Phương pháp 4<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
n<br />
<br />
%<br />
<br />
Bacteroides spp<br />
<br />
24<br />
<br />
48,0<br />
<br />
22<br />
<br />
47,8<br />
<br />
19<br />
<br />
44,2<br />
<br />
25<br />
<br />
30,1<br />
<br />
Prevotella spp<br />
<br />
5<br />
<br />
10,0<br />
<br />
5<br />
<br />
10,9<br />
<br />
7<br />
<br />
16,3<br />
<br />
14<br />
<br />
16,9<br />
<br />
Clostridium<br />
<br />
3<br />
<br />
6,0<br />
<br />
2<br />
<br />
4,3<br />
<br />
2<br />
<br />
4,7<br />
<br />
11<br />
<br />
13,3<br />
<br />
Gemella<br />
<br />
2<br />
<br />
4,0<br />
<br />
2<br />
<br />
4,3<br />
<br />
2<br />
<br />
4,7<br />
<br />
3<br />
<br />
3,6<br />
<br />
133<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017<br />
Fusobacterium spp<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
2,4<br />
<br />
Propionibacterium<br />
<br />
11<br />
<br />
22,0<br />
<br />
10<br />
<br />
21,7<br />
<br />
9<br />
<br />
20,9<br />
<br />
8<br />
<br />
9,7<br />
<br />
Actinomyces<br />
<br />
1<br />
<br />
2,0<br />
<br />
1<br />
<br />
2,2<br />
<br />
1<br />
<br />
2,3<br />
<br />
3<br />
<br />
3,6<br />
<br />
Micromonas micros<br />
<br />
1<br />
<br />
2,0<br />
<br />
1<br />
<br />
2,2<br />
<br />
1<br />
<br />
2,3<br />
<br />
9<br />
<br />
10,8<br />
<br />
Các loại khác<br />
<br />
3<br />
<br />
6,0<br />
<br />
3<br />
<br />
6,5<br />
<br />
2<br />
<br />
4,7<br />
<br />
8<br />
<br />
9,6<br />
<br />
50<br />
<br />
100<br />
<br />
46<br />
<br />
100<br />
<br />
43<br />
<br />
100<br />
<br />
83<br />
<br />
100<br />
<br />
Tổng<br />
<br />
Bacteroides spp là VK kị khí được phân lập nhiều nhất và chiếm tỷ lệ cao. Kết quả<br />
này phù hợp với những nghiên cứu đã công bố trên thế giới [3] và trong nước [2].<br />
Không có sự khác biệt về tỷ lệ B. fragilis mọc được bằng các phương pháp sử dụng<br />
khác nhau, nhưng có sự khác biệt về chủng loại VK kị khí khác như: Prevotella spp,<br />
Clostridium, Fusobacterium spp, Micromonas micros… Phương pháp 4 (hệ thống<br />
Whitley anaerobic Workstations) là hệ thống kín nên tránh được tối đa thời gian tiếp<br />
xúc với không khí, đảm bảo cho các loại VK khó mọc tồn tại được nên số lượng các<br />
loại VK kị khí như Prevotella spp, Clostridium, Fusobacterium spp, Micromonas<br />
micros... có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy bởi hệ thống này.<br />
KẾT LUẬN<br />
Qua nghiên cứu, chúng tôi rút ra<br />
kết luận: hệ thống Whitleyanaerobic<br />
Workstations cho tỷ lệ phân lập VK kị khí<br />
cao hơn so với 3 phương pháp còn lại:<br />
phương pháp tạo khí trường bằng phản<br />
ứng hóa học, phương pháp sử dụng túi<br />
genbag và phương pháp sử dụng hệ<br />
thống ANOXOMAT.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
1. Lê Thiều Hoa. Phương pháp nuôi cấy<br />
và phân loại VK kị khí cho một phòng xét<br />
nghiệm không chuyên. Luận án Tiến sỹ<br />
Y học. Trường Đại học Huboldt. Berlin. 1988.<br />
<br />
134<br />
<br />
2. Lê Thiều Hoa. Kết quả nuôi cấy và phân<br />
lập 632 bệnh phẩm tìm VK kị khí tại Khoa Vi<br />
sinh, Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức từ 30 - 12<br />
- 1992 đến 5 - 10 - 1995. Tạp chí Y học Thực<br />
hành. 1996, 11, tr.17-19.<br />
3. Sutter V.L, Citron D.M, Finegold S.M.<br />
Wadsworth anaerobic bacteriology manual.<br />
Ed. 3, St. Louis. Toronto. London. 1980.<br />
4. Kenneth J Ryan C George Ray.Sherris<br />
th<br />
Medical microbiology. 6 edition. pp.326-349.<br />
5. Lynne S Garcia. Clinical microbiology<br />
procedures handbook. 2016, fourth edition,<br />
section 2, section 4, section 5.<br />
6.<br />
Bailay<br />
and<br />
Scott’s.<br />
Diagnostic<br />
Microbiology. Chapter 22: anaerobes of clinical<br />
th<br />
important. 2015, 13 edition. pp.495-528.<br />
<br />