So sánh hiệu quả thu nhận DNA tự do từ huyết tương thai phụ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> SO SÁNH HIỆU QUẢ THU NHẬN DNA TỰ DO TỪ HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ<br /> Lương Bắc An*,***, Quách Thị Hoàng Oanh**, Trịnh Nhựt Thư Hương**, Nguyễn khắc Hân Hoan**,<br /> Lê Quang Thanh**, Đỗ Thị Thanh Thủy*.<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Phát hiện và định lượng DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương thai phụ đang trở thành<br /> hướng đi mới trong sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS). Rất nhiều phòng thí nghiệm đã ứng dụng cffDNA<br /> như là một nguồn vật liệu di truyền quan trọng để xác định giới tính thai nhi, các bệnh lí di truyền và một số<br /> lệch bội nhiễm sắc thể. Trong NIPS, hạn chế lớn nhất khi phân tích cffDNA trong huyết tương thai phụ là hàm<br /> lượng cffDNA thấp (chỉ chiếm 3 - 13% trong tổng số cfDNA huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai) và độ tinh<br /> sạch của cfDNA sau tách chiết, cả hai yếu tố này đều tác động tới độ nhạy của xét nghiệm. Vì vậy, phương pháp<br /> tối ưu để tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ đóng vai trò quan trọng trong xét nghiệm NIPS.<br /> Mục tiêu: So sánh hiệu quả của 3 bộ kít tách chiết cfDNA từ mẫu huyết tương thai phụ.<br /> Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Nghiên cứu so sánh hiệu quả 3 quy trình tách chiết gồm 1<br /> phương pháp sử dụng công nghệ hạt từ (MagMAX circulating DNA (Applied Biosystems)) và 2 phương pháp<br /> sử dụng công nghệ cột lọc (QIAamp Curculating Nucleic Acid Kit (QIAGen) và Quick-cfDNATMSerum &<br /> Plasma (Zymo Research)) để thu nhận cfDNA từ 30 mẫu huyết tương thai phụ. Nồng độ cfDNA được đo bằng<br /> hệ thống Qubit flourometer và phân bố kích thước được xác định bằng hệ thống Labchip GX Touch.<br /> Kết quả: Hàm lượng cfDNA khác nhau khi tách chiết từ 3 bộ kít (p = 9e - 11). So sánh nồng độ thu được<br /> giữa các bộ kít, chúng tôi nhận thấy bộ kít MagMAX circulating DNA thu được nồng độ cfDNA cao hơn bộ kít<br /> QIAamp Circulating Nucleic acid (p = 0,00016) và Quick-cfDNATMSerum & Plasma (p = 3,7e - 11).<br /> Kết luận: Phương pháp ly trích cfDNA có thể ảnh hưởng chất lượng và kích thước sản phẩm cfDNA thu<br /> nhận. Chúng tôi nhận thấy bộ kít MagMAX circulating DNA thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với QIAamp<br /> Curculating Nucleic Acid Kit (QIAGen) và Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research).<br /> Từ khóa: cfDNA, cffDNA, NIPS.<br /> ABTRACTS.<br /> COMPARING THE EFFICIENCY OF THREE METHODS IN EXTRACTION OF CELL-FREE DNA<br /> FROM MATERNAL BLOOD.<br /> Luong Bac An, Quach Thi Hoàng Oanh, Trinh Nhut Thu Huong, Nguyen Khac Han Hoan,<br /> Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 185 – 191<br /> <br /> Introduction: Detection and quantification of circulating free fetal (cffDNA) in maternal plasma has<br /> recently emerged as an alternative method for prenatal genetic diagnosis. Many laboratories have shown the<br /> utility of fetal circulating DNA as a unique source of genetic material for noninvasive prenatal evaluation of fetal<br /> gender, genetic disease and aneuploidy. Limitations in using cell-free fetal DNA in plasma for NIPS include the<br /> fetal fraction is low (about 3 - 13% in total cfDNA in maternal plasma with depending on gestational age) and<br /> failure to recover highly purified total cfDNA, both of which impact to assay sensitivity. Therefore, optimal<br /> methods to isolate cell-free fetal DNA from maternal plasma are critical in developing noninvasive fetal DNA<br /> <br /> *Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM,<br /> *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM.<br /> Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com<br /> <br /> 185<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> testing strategies.<br /> Objective: We aimed to compare the efficiency of three methods in extraction of cell free DNA from maternal blood.<br /> Methods: A cross-sectional study. The present study compares the one magnetic-bead based (MagMAX<br /> circulating DNA (Applied Biosystems)) and two column-based (QIAamp circulating Nucleic acid (QIAgen) and<br /> Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research)) using 30 plasma samples from maternal blood. CfDNA<br /> concentration was measured using the Qubit flourometer. DNA fragments length was assessed using the Labchip<br /> GX Touch.<br /> Results: CfDNA concentration were different among the three methods tested (p = 9e - 11). Intermethod<br /> comparisons, we observed that MagMAX circulating DNA method significantly extracted more cfDNA than<br /> QIAamp circulating Nucleic acid (p = 0.00016) and Quick-cfDNATMSerum & Plasma (p = 3.7e - 11),<br /> respectively.<br /> Conclusion: Methods for isolation of cfDNA can affect DNA yield and molecular weight fractions recovery.<br /> We confirm that the MagMAX circulating DNA method provides the highest cfDNA yield than QIAamp<br /> circulating Nucleic acid (QIAgen) and Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research).<br /> Key words: circulating free DNA (cfDNA), NIPS, cffDNA.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ. các thành phần gây ức chế phản ứng phân tích.<br /> Hãng QIAgen phát triển các bộ kít thương mại<br /> Khám phá sự hiện diện của của DNA thai<br /> chuyên biệt trong tách chiết cfDNA nhằm thu<br /> tự do (cffDNA) trong huyết tương thai phụ<br /> được hoàn toàn cfDNA với các đoạn có kích<br /> đang trở thành chủ đề được quan tâm hiện<br /> thước nhỏ (75bp). Trong đó có bộ kít QIAamp<br /> nay. CffDNA xuất hiện rất sớm trong giai đoạn<br /> đầu thai kì (tuần thứ 6 thai kì) và hàm lượng Circulating Nucleic Acid chuyên dụng để thu<br /> cffDNA tăng dần theo tuổi thai, sau đó biến nhận cfDNA từ huyết tương. Nghiên cứu của<br /> mất hoàn toàn sau khi sinh(8). Trong sàng lọc Gabrila và cộng sự khi so sánh khả năng thu<br /> tiền sản không xâm lấn (NIPS), cffDNA có ý nhận cfDNA từ 3 bộ kít khác nhau của hãng<br /> nghĩa rất quan trọng trong việc phát hiện một QIAgen cho thấy khả năng tách chiết của<br /> số bệnh lí của thai nhi gồm một số lệch bội QIAamp Circulating Nucleic acid tốt hơn so<br /> nhiễm sắc thể của T21, T18, T13 cũng như các với QIAamp DSP Virus kit (p < 0.001) và<br /> rối loại di truyền đơn gen khác như các rối loạn QIAamp DNA Blood Mini kit (p < 0.0001)(9).<br /> liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính, nhóm Tuy nhiên, giá thành cho bộ kít QIAamp<br /> máu Rhesus (RhD), -thalasemia, tăng sản Circulating Nucleic acids thông thường rất cao.<br /> tuyến thượng thận bẩm sinh,… Do đặc điểm cfDNA khó thu hồi bằng các<br /> Trở ngại lớn khi áp dụng cffDNA vào trong bộ kít li trích tay thông thường nên hầu hết<br /> NIPS là do hàm lượng cffDNA rất thấp so các hãng thực hiện xét nghiệm NIPT đều<br /> cfDNA mẹ trong mẫu huyết tương (3 - 13% thực hiện bước chuẩn bị mẫu bằng các bộ kít<br /> trong tổng số cfDNA huyết tương thai phụ tùy ly trích thực hiện trên hệ thống máy tách<br /> theo tuổi thai) và kích thước ngắn (50 - chiết tự động. Macherey & Nagel là một<br /> 150bp)(2,10). Chính vì vậy, phương pháp tách trong những hãng phát triển các bộ kít li<br /> chiết phù hợp có thể thu nhận tối đa lượng trích cho máy li trích tự động, bên cạnh đó<br /> cfDNA với độ tinh sạch cao là điểm mấu chốt hãng cũng phát triển các bộ kít tách cfDNA<br /> bằng quy trình thường quy như bộ kít<br /> trong xét nghiệm NIPS. CfDNA có chất lượng<br /> NucleoSpin Plasma XS (Macherey & Nagel<br /> tốt giúp hạn chế kết quả âm tính giả do thất<br /> (MN)), có đặc điểm nổi bật như thu hồi được<br /> thoát DNA trong quá trình thao tác hoặc tồn tại<br /> <br /> <br /> 186<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> các đoạn cfDNA có kích thước 50 - 1000bp, dụng ống Streck BCT để thu nhận mẫu máu.<br /> sử dụng công nghệ cột lọc cải tiến cho phép Thai phụ được lấy 10ml máu chứa trong ống<br /> lượng buffer dung giải dùng thu hồi cfDNA Streck BCT, lập tức đảo ống 180o khoảng 10 lần<br /> chỉ cần từ 5 - 30ul. Tuy nhiên, theo một số để máu trộn đều với các chất bảo quản bên<br /> chuyên gia về xét nghiệm NIPS, công nghệ trong ống. Nếu chưa xử lý kịp thời, có thể lưu<br /> của cột lọc của hãng Macherey & Nagel mẫu ở nhiệt độ phòng (18oC - 25oC) trong vòng<br /> không tốt bằng hãng QIAGen(5). Nghiên cứu 14 ngày. Li tâm ống máu với tốc độ 1,600 rpm<br /> của Clause và cộng sự so sánh giữa các trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó nhẹ<br /> phương pháp tách chiết bằng hạt từ nhàng hút lớp huyết tương phía trên, chú ý<br /> (NucliSens Magnetic Extraction) và phương không chạm phần buffy coat. Li tâm lần 2<br /> pháp cột lọc (QIAamp DSP Virus và QIAamp huyết tương vừa thu được với tốc độ 13,000<br /> DNA Blood Mini) cho thấy hiệu quả tách rpm trong 10 phút ở 4oC. Dịch nổi được thu<br /> chiết bằng công nghệ hạt từ cho kết quả tốt nhận vào 3 ống eppendorf, trong đó mỗi ống<br /> hơn và bộ kít QIAamp DSP Virus tách được chứa 1 ml huyết tương. Mẫu huyết tương được<br /> nồng độ cfDNA cao hơn QIAamp DNA trữ trong tủ -80oC.<br /> Blood Mini(4). Từ đó cho thấy, xác định được Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Y Sinh<br /> bộ kít phù hợp là điều vô cùng cần thiết khi học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM.<br /> tách chiết cfDNA từ mẫu huyết tương.<br /> Tách chiết mẫu huyết tương<br /> Ngoài ra, một số yếu tố cũng liên quan tới<br /> 30 mẫu huyết tương được tách chiết lần<br /> hiệu quả tách chiết cfDNA như điều kiện xử lí<br /> lượt với 3 bộ kít của các hãng sản xuất khác<br /> mẫu ban đầu, điều kiện phòng thí nghiệm và<br /> nhau. Trong đó, 2 phương pháp cột lọc gồm kít<br /> kỹ thuật thao tác.<br /> QIAamp Circulating Nucleic acid (QIA) và kít<br /> Với mục tiêu so sánh hiệu quả quy trình Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo)) và 1<br /> tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ, bộ kít sử dụng hạt từ (MagMAX circulating<br /> chúng tôi thực hiện so sánh quy trình tách DNA (MagMAX)). Quy trình thực hiện theo<br /> chiết của 3 hãng sản xuất khác nhau gồm 2 hướng dẫn của từng nhà sản xuất. Tất cả các<br /> quy trình sử dụng công nghệ cột lọc phương pháp đều sử dụng lượng mẫu đầu vào<br /> (QIAamp Curculating Nucleic Acid Kit là 1 ml huyết tương. Thể tích dung dịch đệm sử<br /> (QIAGen) và Quick-cfDNATMSerum & dụng thu hồi cfDNA là 30ul cho tất cả các<br /> Plasma (Zymo Research)) và 1 quy trình sử phương pháp.<br /> dụng công nghệ hạt từ (MagMAX circulating<br /> Đo nồng độ cfDNA sau khi tách chiết<br /> DNA (Applied Biosystems)) để thu nhận<br /> cfDNA từ huyết tương thai. CfDNA sau tách chiết được xác định nồng<br /> độ bằng bộ kít Qubit dsDNA HS (High<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU. Sensitivity) Assay kit (Thermo Fisher) trên hệ<br /> Thiết kế nghiên cứu thông Qubit 3.0 Flourometer (Invitrogen, Lie<br /> Mô tả cắt ngang. Technologies, CA, USA). Các bước chuẩn bị<br /> gồm: chuẩn bị buffer đo bằng cách pha Qubit<br /> Phương pháp nghiên cứu.<br /> dsDNA HS Reagent và Qubit dsDNA HS<br /> Đối tượng nghiên cứu buffer theo tỉ lệ 1:200. Mẫu đo được pha từ 2µL<br /> Đối tượng nghiên cứu là thai phụ tại Bệnh mẫu cfDNA với 198µL buffer đo (chuẩn bị<br /> viện Từ Dũ trong thời gian từ tháng 10/2017 riêng cho mỗi lần đo) và mẫu chuẩn được pha<br /> đến tháng 5/2018. Số lượng mẫu trong nghiên từ 10µl chất chuẩn (cung cấp theo bộ kít) với<br /> cứu là 30 mẫu. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ sử 190µL. Sử dụng ống Qubit để chứa mẫu đo.<br /> <br /> <br /> <br /> 187<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> Vortex các ống mẫu và ống chuẩn. Ủ mẫu và động từ 0,1 - 0,312ng/µl. Trong ba bộ kít thì kít<br /> ống chuẩn tại nhiệt độ phòng trong 2 phút MagMAX cho kết quả nồng độ cfDNA trung<br /> (tránh sáng) rồi tiến hành đo. bình cao nhất với 0,263ng/µl (95% CI: 0,205 -<br /> Phân tích kích thước của cfDNA 0,291), biên độ dao động từ 0,093 - 0,591ng/µl.<br /> Kích thước cfDNA được phân tích bằng hệ Kiểm tra sự khác biệt về nồng độ cfDNA<br /> thống điện di mao quản LabChip GX Touch 24 thu được từ 3 bộ kít cho thấy có sự khác biệt có<br /> (PerkinElmer), sử dụng bộ kít DNA High ý nghĩa thông kê (p = 9e - 11)(kiểm định<br /> Sensitivity Reagent Kit (PerkinElmer) đi kèm ANOVA). Nồng độ cfDNA trung bình thu<br /> thang chuẩn LapChip DNA Extended Range được từ bộ kít MagMAX cao hơn 1,38 lần so với<br /> (50 - 7000bp) (PerkinElmer). Kết quả được phân bộ kít QIA (p = 0.0019) và cao hơn 2,53 lần so<br /> tích bằng phần mềm Labchip®GX Reviewer. với bộ kít Zymo (p = 3,7e - 11). Trong khi đó,<br /> nồng độ cfDNA trung bình thu được từ bộ kít<br /> Xử lí số liệu<br /> QIA cao hơn 1,83 lần so với bộ kít Zymo (p =<br /> Tất cả các số liệu được xử lí bằng phần 0,00016). Sự khác biệt nồng độ có ý nghĩa thống<br /> mềm R (phiên bản 3.4.4). Sự khác biệt về nồng kê (hậu kiểm định Tukey với p < 0.05). Vì vậy,<br /> độ cfDNA thu được từ các phương pháp tách trong 3 bộ kít thì bộ kít MagMAX cho phép thu<br /> chiết khác nhau được kiểm định phương sai được nồng độ cfDNA cao nhất, ngược lại bộ kít<br /> ANOVA-một chiều (với p < 0.05 được coi là có Zymo có nồng độ cfDNA thu được là thấp nhất<br /> ý nghĩa thống kê). Kiểm định Tukey đánh giá (hình 1).<br /> sự khác biệt giữa các nhóm.<br /> Trong 30 mẫu huyết tương tách bằng bộ kít<br /> KẾT QUẢ. Zymo có 18 mẫu (60%) đạt nồng độ nhỏ hơn<br /> So sánh nồng độ cfDNA giữa các bộ kít 0,1ng/µl. Trong khi đó, chỉ duy nhất 1 mẫu<br /> Sản phẩm cfDNA thu được sau khi tách (3,3%) tách bằng bộ kít MagMAX đạt nồng độ<br /> chiết được xác định nồng độ bằng hệ thống thấp hơn 0,1ng/µl và không có mẫu nào tách<br /> Qubit®3.0 Fluorometer. Nồng độ cfDNA thu bằng bộ kít QIA thấp hơn nồng độ này.<br /> được từ các bộ kít khác nhau được tóm tắt<br /> trong bảng 1.<br /> Bảng 1: Nồng độ cfDNA thu được từ các bộ kít<br /> khác nhau.<br /> Nồng độ Nồng độ Nồng độ Khoảng tin<br /> Bộ kítTBình thấp nhất cao nhất cậy 95% (CI)<br /> (ng/µl) (ng/µl) (ng/µl) (ng/µl)<br /> Zymo 0,104 0,052 0,277 0,065-0,110<br /> QIA 0,190 0,100 0,312 0,150-0,227<br /> MagMAX 0,263 0,093 0,591 0,205-0,291<br /> Kết quả nồng độ cfDNA thu được sau khi<br /> tách chiết 30 mẫu huyết tương cho thấy nồng<br /> độ cfDNA thu được từ các bộ kít có sự biến<br /> động lớn. Nồng độ cfDNA trung bình thu được<br /> từ bộ kít Zymo là 0,104ng/µl (95% CI: 0,065 -<br /> 0,110) với dao động từ 0,052 - 0,277ng/µl. Trong Hình 1: Nồng độ cfDNA được tách chiết từ 3 bộ kít<br /> khi đó, bộ kít QIA cho thấy nồng độ cfDNA thu khác nhau.<br /> được cao hơn với nồng độ trung bình đạt gần Phân bổ kích thước cfDNA giữa các bộ kít<br /> 0,2 ng/µl (95% CI: 0,150 - 0,227), khoảng dao<br /> <br /> <br /> <br /> 188<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Kích thước cfDNA dao động từ 150 - với bộ kít Zymo (đường màu xanh) là thấp<br /> 300bp, phân tích nồng độ cfDNA tại vùng nhất, tiếp theo là hàm lượng cfDNA tách<br /> kích thước này cho thấy có sự khác nhau về bằng bộ kít QIA (đường màu đỏ) và cao nhất<br /> nồng độ cfDNA được thu nhận từ các 3 bộ là cfDNA được tách bằng kít MagMAX<br /> kit. Trong đó, hàm lượng cfDNA thu được (đường màu đen) (hình 2).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Sự phân bố kích thước cfDNA tách bằng các bộ kít khác nhau.<br /> Các kít sử dụng trong nghiên cứu đều được quả thu nhận cfDNA cao nhất trong 3 bộ kít, và<br /> các nhà sản xuất thiết kế chuyên biệt cho li trích nồng độ cfDNA chủ yếu tập trung tại vùng 100 -<br /> cfDNA nhằm mục đích thu được tối đa lượng 300bp, rất ít cfDNA có kích thước > 300bp được<br /> cfDNA. Tuy nhiên, mỗi nhà sản xuất phát triển thu nhận. Do cffDNA có kích thước nhỏ hơn<br /> những công nghệ riêng cho bộ kít của mình. Bộ 150bp(2) nên các phân mảnh lớn 300bp hầu như<br /> kít Zymo sử dụng công nghệ cột lọc màng silica không có ý nghĩa trong nghiên cứu các bất<br /> để thu giữ cfDNA trong quá trình tách chiết, với thường của cffDNA, ngược lại còn làm giảm đi<br /> công nghệ cột lọc cho phép dung giải cfDNA với hàm lượng cffDNA (fetal fraction). Do đó, bộ kít<br /> thể tích nhỏ (25µl) nhằm tăng nồng độ cfDNA MagMAX có hiệu quả tách chiết tối ưu nhất<br /> sau tách chiết. Tuy nhiên, nồng độ cfDNA và trong 3 bộ kít được khảo sát trong nghiên cứu<br /> hàm lượng cfDNA có kích thước 100 - 300bp đều của chúng tôi.<br /> thấp hơn so với 2 bộ kít còn lại, có thể do các BÀN LUẬN<br /> cfDNA có kích thước nhỏ bị thất thoát trong quá<br /> Thu nhận được cfDNA chất lượng cao tác<br /> trình tách chiết. Ngoài khả năng dung giải<br /> động rất lớn đến kết quả NIPS. Do nồng độ và<br /> cfDNA với thể tích nhỏ thì bộ kít QIA có bổ sung<br /> kích thước cfDNA rất nhỏ, đồng thời trong<br /> thêm RNA-carriers, giúp tăng khả năng thu<br /> huyết tương còn chứa nhiều thành phần khác<br /> nhận được nhiều nhất lượng cfDNA. Nồng độ<br /> như protein, vi lượng, dễ gây ức chế phản ứng<br /> cfDNA thu từ bộ kít QIA tại vùng 100 - 300bp,<br /> phân tích là các yếu tố gây ra kết quả âm tính<br /> cao hơn bộ kít Zymo. Ngoài ra bộ kít QIA còn<br /> giả. Chính vì vậy, phương pháp tách chiết cần<br /> thu được cfDNA có kích thước > 300bp cao hơn 2<br /> được tối ưu hoá với mục đích thu hồi được tối<br /> bộ kít còn lại (hình 2). Bộ kít MagMAX, sử dụng<br /> đa lượng cfDNA trong mẫu huyết tương với<br /> công nghệ hạt từ để thu nhận cfDNA, có hiệu<br /> <br /> <br /> 189<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> độ tinh sạch cao. Trong nghiên cứu này, chúng ra, trong 30 mẫu tách chiết bằng bộ kít Zymo cho<br /> tôi thực hiện đánh giá hiệu quả tách chiết của thấy có 60% lượng mẫu có nồng độ < 0,1ng/µl,<br /> 3 bộ kít từ các hãng sản xuất khác nhau gồm: chưa đạt được lượng mẫu giới hạn cho phép<br /> kít QIAamp Circulating Nucleic acid trong bước chuẩn bị thư viện giải trình tự(3).<br /> (QIAgen), kít Quick-cfDNATMSerum & Plasma Trong khi đó, bộ kít QIA có khả năng thu<br /> (Zymo Research) và kít MagMAX circulating được các cfDNA có kích thước lớn hơn 75bp và<br /> DNA (Applied Biosystems). Không giống các có bổ sung RNA-carrier, do đó cfDNA giữ lại<br /> bộ kít phát triển để phân lập DNA bộ gen, các được nhiều hơn. Tuy nhiên, phân tích kích thước<br /> kít này được phát triển chuyên biệt cho ly cfDNA cho thấy các đoạn có kích thước lớn<br /> trích cfDNA với kích thước nhỏ và nồng độ rất 300bp được thu nhận khá nhiều, đây hầu hết là<br /> thấp. Chính vì vậy lượng mẫu đầu vào có thể DNA genome của người mẹ, không có giá trị<br /> thay đổi cũng như điều chỉnh được lượng trong phân tích bất thường DNA thai. Sự tồn tại<br /> buffer trong bước dung giải thu hồi nhằm tăng của cfDNA có kích thước lớn hơn 300bp sẽ làm<br /> nồng độ cfDNA. Trong nghiên cứu này, tất cả cho hàm lượng cffDNA thấp bất thường, tác<br /> các bộ kít đều sử dụng lượng mẫu đầu vào là 1 động lớn tới kết quả phân tích. Ngoài ra, RNA-<br /> ml huyết tương được lấy từ cùng 1 thai phụ và Carrier được xem là một nhân tố ức chế hoạt<br /> lượng mẫu buffer sử dụng trong bước dung tính một số enzym trong các phản ứng phân tích.<br /> giải thu hồi cfDNA là 30µl. Do đó, chúng tôi<br /> Chất lượng cfDNA thu được bằng bộ kít<br /> có thể đánh giá được hiệu quả tách chiết của<br /> MagMAX cho thấy có nhiều ưu điểm như nồng<br /> từ bộ kít thông qua nồng độ cfDNA thu được<br /> độ thu được cao hơn so với 2 bộ kít còn lại, ngoài<br /> và sự phân bố kích thước cfDNA.<br /> ra nồng độ này đều tập trung chủ yếu tại vùng<br /> Thực tế cho thấy, nồng độ cfDNA trong DNA có kích thước 100 - 300bp. Do đó, đây được<br /> huyết tương rất biến động tuỳ vào từng mẫu. xem là bộ kít tối ưu nhất trong 3 bộ kít sử dụng<br /> Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nồng độ này tách cfDNA từ mẫu huyết tương thai phụ.<br /> dao động khác nhau tuỳ từng bộ kít sử dụng để<br /> Có nhiều báo cáo kết quả so sánh từ nhiều<br /> tách chiết, thí dụ kít Zymo thu được nồng độ từ<br /> phương pháp tách chiết khác nhau. Xue và cộng<br /> 0,052 đến 0,277ng/µl, kít QIA thu được từ 0,1đến<br /> sự đã so sánh bộ kít QIAamp (Qiagen) với quy<br /> 0,312 ng/µl và kít MagMAX thu được từ 0,093<br /> trình tách chiết mẫu huyết tương được xử lí<br /> đến 0,591ng/µl. Các yếu tố khách quan tác động<br /> nhiệt trong dung dịch triton X-100 và được tinh<br /> nồng độ cfDNA tổng số thông thường do trạng<br /> sạch với phenol/cloroform (THP). Kết quả cho<br /> thái sinh lí người mẹ và thai nhi(1). Ngoài ra một<br /> thấy quy trình THP cho hàm lượng cfDNA thu<br /> số các yếu tố chủ quan như quá trình xử lí mẫu<br /> được cao hơn so với phương pháp sử dụng cột<br /> ban đầu, phương pháp tách chiết hay do thao tác<br /> lọc(11). Tuy nhiên quy trình THP tương đối độc<br /> của người thực hiện cũng ảnh hưởng nhiều tới<br /> hại và tốn nhiều thời gian thực hiện, không thích<br /> nồng độ cfDNA thu nhận, trong đó, phương<br /> hợp để tích hợp vào các quy trình NIPS thường<br /> pháp tách chiết được cho là ảnh hưởng nhiều<br /> qui. Năm 2005, nhằm xây dựng được một<br /> nhất tới nồng độ cfDNA(5).<br /> phương pháp tiêu chuẩn cho phân lập cfDNA từ<br /> Chiều dài của cfDNA tương đối nhỏ (150 - mẫu huyết tương thai phụ, một dự án với sự<br /> 300bp), đặc biệt chiều dài cffDNA thường nhỏ tham gia của 12 tổ chức tại châu Âu đã được<br /> hơn 150bp và có tính phân mảnh cao(2). Theo thành lập và so sánh hàm lượng DNA thu được<br /> hướng dẫn của bộ kít Zymo thì màng lọc chỉ giữ giữa các qui trình thường quy của mỗi phòng thí<br /> lại được các đoạn cfDNA có kích thước lớn hơn nghiệm, kết quả kít QIAamp DSP Virus có kết<br /> 100bp, do đó hiệu suất thu nhận cfDNA chưa quả tốt nhất trong các bộ kít được khảo sát(7). Tuy<br /> thật tối ưu, đặc biệt là các đoạn cffDNA. Ngoài nhiên, năm 2009 hãng QIAgen giới thiệu bộ kít<br /> <br /> <br /> 190<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> QIAamp Circulating Nucleic acid có hiệu quả 2. Chan KA, Zhang J, Hui AB et al (2004). Size distributions of<br /> maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 50(1),<br /> tách chiết tốt hơn(9). Kết quả nghiên cứu của 88–92.<br /> chúng tôi tương đồng với kết quả công bố của 3. Chang BC, Chareonsirisuthigul T, Janchompoo P et al (2016).<br /> Setting Up of First NIPT Service Laboratory in a Thailand<br /> Jorgez và cộng sự đều cho thấy cfDNA được<br /> Hospital. J Gener Seq Appl, 3(3), 1–5.<br /> tách chiết bằng công nghệ hạt từ cho kết quả tốt 4. Clausen FB, Krog GR, Rieneck K. et al (2007). Improvement in<br /> hơn các phương pháp khác(6). fetal DNA extraction from maternal plasma. Evaluation of the<br /> NucliSens Magnetic Extraction system and the QIAamp DSP<br /> Tiềm năng ứng dụng của cfDNA là vô cùng Virus Kit in comparison with the QIAamp DNA Blood Mini Kit.<br /> lớn, không chỉ trong NIPS mà còn đặc biệt hữu Prenat Diagn, 27(1), 6–10.<br /> 5. Huang DJ, Mergenthaler-Gatfield S, Hahn S et al (2008).<br /> ích trong nghiên cứu về ung thư. Nồng độ Isolation of cell-free DNA from maternal plasma using manual<br /> cfDNA trong huyết tương rất có ý nghĩa trong and automated systems. Prenatal Diagnosis. Springer, 203–208.<br /> chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi liệu pháp điều 6. Jorgez CJ, Dang DD, Simpson JL et al (2006). Quantity versus<br /> quality: optimal methods for cell-free DNA isolation from<br /> trị ở bệnh nhân ung thư, đột quỵ, nhiễm trùng plasma of pregnant women. Genet Med, 8(10), 615<br /> huyết,… Chính vì vậy, nghiên cứu so sánh khả 7. Legler TJ, Liu Z., Mavrou A et al (2007). Workshop report on the<br /> extraction of foetal DNA from maternal plasma. Prenat Diagn,<br /> năng thu nhận cfDNA từ mẫu huyết tương có<br /> 27(9), 824–829.<br /> thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như ung 8. Lo YD, Zhang J, Leung TN et al (1999). Rapid clearance of fetal<br /> thư và bệnh truyền nhiễm. DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet, 64(1), 218–224.<br /> 9. Repiská G, Sedláčková T, Szemes T et al.(2013). Selection of the<br /> KẾT LUẬN optimal manual method of cell free fetal DNA isolation from<br /> maternal plasma. Clin Chem Lab Med, 51(6), 1185–1189.<br /> Phương pháp ly trích cfDNA có thể ảnh 10. Straver R, Oudejans C, Sistermans EA et al (2016). Calculating<br /> hưởng nồng độ và sự phân bố kích thước sản the fetal fraction for noninvasive prenatal testing based on<br /> genome-wide nucleosome profiles. Prenat Diagn, 36(7), 614–621.<br /> phẩm cfDNA thu nhận. Chúng tôi nhận thấy bộ 11. Xue X, Teare MD, Holen I et al (2009). Optimizing the yield and<br /> kít MagMAX Circulating DNA thể hiện nhiều utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum. Clin<br /> ưu điểm như nhanh chóng, đơn giản, nhạy và Chim Acta, 404(2), 100–104.<br /> <br /> đặc hiệu khi li trích cfDNA từ mẫu huyết tương.<br /> Ngày nhận bài báo: 10/06/2018<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO.<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018<br /> 1. Ashoor G, Poon L, Syngelaki A, et al (2012). Fetal fraction in<br /> maternal plasma cell-free DNA at 11–13 weeks’ gestation: effect Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018<br /> of maternal and fetal factors. Fetal Diagn Ther, 31(4), 237–243.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 191<br />