Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của chế phẩm tai nấm vàng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> TÁC ĐỘNG CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA CHẾ PHẨM<br /> TAI NẤM VÀNG<br /> Nguyễn Thị Thùy Linh*, Võ Phùng Nguyên*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của sản phẩm Tai Nấm Vàng (TNV) – sản phẩm<br /> từ sự kết hợp bốn loại nấm Linh chi, Vân chi, Thái dương và Hầu thủ.<br /> Phương pháp: Tác động chống oxy hóa và bảo vệ gan được nghiên cứu trên mô hình gây tổn thương gan<br /> chuột nhắt cấp tính bằng CCl4. Chuột được cho uống TNV dự phòng 7 hoặc 14 ngày với liều 1,4 g/kg thể trọng<br /> x 2 lần/ngày trước khi chuột được gây viêm gan cấp bằng tetraclorua carbon (CCl4) tiêm phúc mô 0,25%, 10<br /> mL/Kg. Các chỉ số sinh hóa ALT, AST, bilirubin huyết thanh và malondialdehyd (MDA), protein carbonyl (PC)<br /> mô được xác định để đánh giá tác động của TNV. Giải phẫu bệnh học gan chuột cũng được xem xét.<br /> Kết quả: CCl4 gây tăng các men transaminase, bilirubin huyết thanh, MDA và protein carbonyl mô gan ở<br /> chuột. Các tác động này bị giảm khi được dùng trước TNV. Các kết quả về xét nghiệm mô bệnh học hỗ trợ thêm<br /> cho các kết quả sinh hóa.<br /> Kết luận: Tai Nấm Vàng có tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan ở chuột ở liều cho uống 1,4 g/kg thể trọng,<br /> 2 lần/ngày trong 7 và 14 ngày.<br /> Từ khóa: Tai nấm vàng TNV, Linh chi, Vân chi, Thái dương, Hầu thủ, chống oxy hóa, bảo vệ gan,<br /> malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PC), carbon tetraclorua (CCl4), chuột nhắt<br /> ANTIOXIDANT, HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY OF “TAI NAM VANG”<br /> Nguyen Thi Thuy Linh, Vo Phung Nguyen<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 487 - 493<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Objective: Evaluate the antioxidant, hepatoprotective activity of TAI NAM VANG – a product of the<br /> combination of four mushrooms: Ganoderma lucidum (GL), Trametes versicolor (TV), Agaricus blazei (AB) and<br /> Hericium erinaceus (HE).<br /> Method: Antioxidant and hepatoprotective activity of TNV were studied on the model of acute carbon<br /> tetraclorua – induced liver damage in mice. Mice were orally administered TNV at the dose 1.4 g/kg b.w, twice a<br /> day for 7 or 14 days as prophylaxis treatment before given intraperitoneally injection of single dose CCl4 0.25%,<br /> 10 mL/Kg. Biochemical parameters such as serum ALT, AST, bilirubin; liver tissue malondialdehyde (MDA)<br /> and protein carbonyl (PC) were measured to evaluate antioxidant and hepatoprotective activity of TNV. Liver<br /> sections of mice were also histopathological examined.<br /> Result: CCl4 treatment induced an increase in serum transaminase, bilirubin and tissue MDA, PC in mice.<br /> These effects were reduced by pretreatment with TNV. These biochemical results were supported by<br /> histopathological results<br /> Conclusion: The study confirms the antioxidant and hepatoprotective activity of TNV given 1,4 g/kg twice<br /> for 7 and 14 days in mice.<br /> Keywords: Ganoderma lucidum (GL), Trametes versicolor (TV), Agaricus blazei (AB) and Hericium<br /> *Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Thị Thùy Linh ĐT: 0984454133<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Email: linhviky@yahoo.com<br /> <br /> 487<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> erinaceus (HE), antioxidant, hepatoprotective, malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PC), carbon<br /> tetraclorua (CCl4), mice.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Oxy hóa là một quá trình sinh lý bình<br /> thường trong cơ thể, nhưng khi có sự mất cân<br /> bằng giữa gốc tự do sinh ra trong quá trình<br /> này và các yếu tố bảo vệ nội sinh có thể là<br /> nguyên nhân dẫn đến rất nhiều bệnh khác<br /> nhau như: bệnh về thần kinh, ung thư, huyết<br /> áp,… Chính vì vậy, việc tìm kiếm thêm các<br /> nguồn chất chống oxy hóa đang thu hút sự<br /> quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Cho tới<br /> hiện nay đã có nhiều dược liệu được chứng<br /> minh là có khả năng phòng ngừa, ngăn chặn<br /> sự oxy hóa, bảo vệ gan như sữa ong chúa, trà<br /> xanh, atiso, các loại nấm Linh chi, Vân chi,<br /> Thái dương, Hầu thủ…(2,5)<br /> Tai Nấm Vàng (TNV) là một chế phẩm bao<br /> gồm 4 loại nấm quý: Linh chi, Vân chi, Thái<br /> dương, Hầu thủ hứa hẹn đây là một chế phẩm<br /> có nhiều công dụng quý, trong đó có khả năng<br /> chống oxy hóa và bảo vệ gan. Việc nghiên cứu<br /> tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của viên<br /> TNV sẽ góp phần làm rõ cơ chế tác động của<br /> thuốc cũng như đóng góp cho sự phát triển nền<br /> y học dân tộc và nhu cầu sử dụng của nhân dân.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Động vật thử nghiệm:<br /> Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino,<br /> trọng lượng 22 g ± 2 g, do viện vắc-xin và sinh<br /> phẩm Nha trang cung cấp. Chuột được nuôi ổn<br /> định trong hộp nhựa (28x25x15cm) 2 ngày trước<br /> khi thử nghiệm và được cung cấp đầy đủ thức<br /> ăn và nước uống.<br /> <br /> Nguyên liệu:<br /> Chế phẩm viên nang Tai Nấm Vàng do<br /> công ty trách nhiệm hữu hạn Giai Cảnh sản xuất<br /> và cung cấp với thành phần:<br /> Cao khô nấm Thái Dương<br /> <br /> 17,57 mg<br /> <br /> Cao khô nấm Vân Chi<br /> <br /> 17,57 mg<br /> <br /> Cao khô nấm Hầu Thủ<br /> <br /> 17,57 mg<br /> <br /> Cao khô nấm Linh Chi<br /> <br /> 122,99 mg<br /> <br /> 488<br /> <br /> Tá dược: Magnesi carbonat nhẹ, Aerosil, bột<br /> Talc, Magnestearat vừa đủ 460 mg.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Khảo sát khả năng bảo vệ của viên TNV sử<br /> dụng uống dự phòng 7 ngày và 14 ngày liều 1,4<br /> g/kg x 2 lần/ngày trước khi gây độc gan chuột<br /> bằng cách tiêm phúc mô CCl4 0,25% 10 mL/Kg<br /> khi pha trong dầu olive. Ở mỗi thử nghiệm<br /> chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10<br /> con, gồm lô trắng (uống nước cất ED); lô chứng<br /> (uống nước cất, tiêm olive); lô uống TNV, tiêm<br /> olive; lô gây độc (uống nước cất ED, tiêm CCl4)<br /> và lô thử (uống TNV, tiêm CCl4).<br /> <br /> Đánh giá<br /> Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): được<br /> đánh<br /> giá<br /> thông<br /> qua<br /> hàm<br /> lượng<br /> malondialdehyde (MDA) và protein carbonyl<br /> (PC) mô gan.<br /> Tác động bảo vệ gan được khảo sát ở mức<br /> độ mô học và thông qua chỉ số sinh hóa gan men<br /> gan ALT, AST và bilirubin huyết thanh.<br /> Xác định hàm lượng MDA<br /> MDA là một trong các sản phẩm cuối cùng<br /> của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, một<br /> phân tử MDA phản ứng với hai phân tử<br /> thiobarbituric ở môi trường pH 2-3, nhiệt độ 90100 oC trong 60 phút tạo phức màu hồng hấp<br /> thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo cường độ<br /> màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu.<br /> Nếu lượng MDA ở mẫu thử giảm có ý nghĩa<br /> thống kê so với mẫu gây mô hình, mẫu thử<br /> được xác định là có hoạt tính chống oxy hóa. (2)<br /> Tiến hành: Mô gan được nghiền tạo dịch<br /> đồng thể 5% trong dung dịch phosphat buffer<br /> saline (PBS, pH 7,4). Lấy 200 µl dịch sau ly tâm<br /> (9500 vòng/phút x15 phút) thêm 500 µl nước<br /> cất, và 100 µl SDS 10% rồi ủ ở 37 oC trong 30<br /> phút. Thêm 500 µl HCl 0,1N, lắc kỹ 15 phút.<br /> Ly tâm lấy 1 ml dịch, thêm vào 250 µl TBA<br /> 0,5%. Đun cách thủy ở 95 oC trong 60 phút rồi<br /> để nguội đến nhiệt độ phòng. Đo quang ở<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> bước sóng 532 nm. Tất cả các giai đoạn từ lấy<br /> mẫu gan, cân cho đến nghiền mẫu đều được<br /> tiến hành ở nhiệt độ 0-4 0C.<br /> Xác định hàm lượng protein carbonyl<br /> Protein carbonyl, một sản phẩm được tạo ra<br /> trong quá trình oxy hóa protein, khi cho phản<br /> ứng với 2,4-dinitrophenylhydrazin tạo tủa. Hòa<br /> tan tủa trong guanidinchlorid cho dung dịch<br /> màu vàng, đo quang ở bước sóng 370 nm (3).<br /> Tiến hành: nghiền mẫu gan tạo dịch đồng<br /> thể 6,7% trong dung dịch đệm PBS pH 6,5. Ly<br /> tâm lấy dịch. Tất cả các giai đoạn từ lấy mẫu,<br /> cân cho đến nghiền mẫu đều được tiến hành ở<br /> nhiệt độ 0-4 0C.<br /> Bảng 1. Hỗn hợp phản ứng định lượng protein<br /> carbonyl<br /> Thành phần<br /> 100 mM PBS (pH 7,2)<br /> 80mM FeSO4.7H2O<br /> 8 mM FeCl3.6H2O<br /> 4 M KCl<br /> 0,4 M MgCl2.2H2O<br /> Mẫu thử<br /> Nước cất<br /> Tổng cộng<br /> <br /> Ống chứng<br /> (μl)<br /> 320<br /> 20<br /> 20<br /> 20<br /> 20<br /> 200<br /> 120<br /> 720<br /> <br /> Ống thử (μl)<br /> 320<br /> 20<br /> 20<br /> 20<br /> 20<br /> 200<br /> 120<br /> 720<br /> <br /> Ủ hỗn hợp ở 30 oC trong 30 phút, cho vào<br /> hỗn hợp 720 µl TCA 20%, ly tâm lấy cắn. Thêm<br /> vào ống chứng 720 µl HCl 2 N, ống thử 720 µl<br /> 2,4- DNPH 0,2%, lắc nhẹ trong 60 phút. Thêm<br /> vào mỗi mẫu 720 µl TCA 20%, vortex 10 giây, ly<br /> tâm (3000 vòng x 15 phút), lấy cắn. Rửa cắn 3 lần<br /> với 1,5 ml dung dịch ethanol/ethyl acetat (1:1),<br /> để khô. Hòa tan trong 1,8 ml guanidinchloride 6<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> M, ly tâm, lấy dịch đo quang ở bước sóng 370<br /> nm.<br /> Xác định hàm lượng protein toàn phần (Phương<br /> pháp Bradford)<br /> Tiến hành: Phản ứng tạo màu của protein và<br /> Coomassie(1). Pha mẫu đo quang theo bảng 2 ở<br /> bước sóng 595 nm.<br /> Bảng 2. Thành phần hỗn hợp phản ứng định lượng<br /> protein toàn phần<br /> Thành phần<br /> Nước<br /> Coomassie<br /> Dịch gan<br /> Tổng cộng<br /> <br /> Ống trắng<br /> 500 μl<br /> 500 μl<br /> 0 μl<br /> 1ml<br /> <br /> Ống thử<br /> 498 μl<br /> 500 μl<br /> 2 μl<br /> 1ml<br /> <br /> Khảo sát mô học:<br /> Mẫu mô gan ở các lô được xử lý nhuộm theo<br /> phương pháp Hematoxylin-eosin tại Bộ môn<br /> giải phẫu bệnh - Đại học Y dược TP. Hồ Chí<br /> Minh.<br /> Xét nghiệm sinh hóa:<br /> Mẫu máu đựng trong ống không có chất<br /> chống đông dùng để xét nghiệm các thông số<br /> thuộc chức năng của gan tại phòng xét nghiệm<br /> sinh hóa - Bệnh viện Chợ Rẫy, TP. Hồ Chí Minh<br /> trên máy xét nghiệm sinh hoá Hitachi 717, thuốc<br /> thử của hãng Biolabo (Pháp).<br /> Phân tích thống kê:<br /> Dữ liệu được trình bày dưới dạng Mean (Số<br /> trung bình) ± SEM (sai số chuẩn của số trung<br /> bình). Sự khác biệt giữa các nhóm được phân<br /> tích bằng phương pháp Mann-Whitney với<br /> phần mềm Minitab 14. P