Tạp chí khoa học: Biểu hiện gen mã hóa cho β-galactosidase trong tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn Bacillus subtilis

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 28 (2012) 207-214<br /> <br /> Bi u hi n gen mã hóa cho β-galactosidase trong t bào sinh dư ng c a vi khu n Bacillus subtilis<br /> Nguy n Quỳnh Uy n*, Tr n Th Trang, Phan Th Hà, Nguy n Huỳnh Minh Quyên<br /> Vi n Vi sinh v t và Công ngh Sinh h c, HQGHN, 144 Xuân Th y, Hà N i, Vi t Nam<br /> Nh n ngày 16 tháng 5 năm 2012<br /> <br /> Tóm t t. Bacillus subtilis ư c Hi p h i Thu c và Th c ph m c a M (FDA) ánh giá là v t ch an toàn. Hơn n a, d a trên trình t b gen ã ư c nghiên c u y , vi sinh v t này ư c s d ng như mô hình trong nghiên c u cơ b n và nghiên c u ng d ng. Tuy nhiên, cho n th i i m hi n t i (theo nh ng thông tin mà chúng tôi có ư c) nh ng nghiên c u bi u hi n gen trong t bào sinh dư ng c a vi sinh v t này, c bi t là bi u hi n không dùng ch t c m ng, v n còn chưa ư c ti n hành r ng rãi t i Vi t Nam. Trong bài báo này chúng tôi ã bi u hi n thành công gen mã hóa cho β-galactosidase như m t gen mô hình trong t bào sinh dư ng c a vi khu n B. subtilis phát tri n ng d ng c a vi sinh v t an toàn này t i Vi t Nam. T khóa: Bacillus subtilis, t bào sinh dư ng, bi u hi n, β-galactosidase.<br /> <br /> 1. M<br /> <br /> u∗<br /> <br /> Bacillus subtilis, i di n tiêu bi u c a nhóm vi sinh v t Gram dương, là m t trong nh ng i tư ng ư c chú tr ng nghiên c u t lâu do nh ng ưu i m n i b t so v i Escherichia coli. Kh năng không gây b nh (B. subtilis ư c Hi p h i Thu c và Th c ph m c a M FDA coi là „genereally regarded as safe“ - GRAS) và kh năng ch u ng các i u ki n nuôi c y, b o qu n kh c nghi t hơn [1, 2] c a B. subtilis là nh ng ưu i m n i tr i c a vi sinh v t này so v i E. coli. Trong nghiên c u cơ b n, B. subtilis ã ư c s d ng như mô hình nghiên c u kh năng bi t hoá và cơ ch i u hoà ho t ng c a gen trong t bào [3]. Trong<br /> <br /> hư ng phát tri n các vacxin th h m i, B. subtilis ã ư c phát hi n và nghiên c u như m t công c chuy n kháng nguyên an toàn và ti m năng [4-6]. M c dù h gen c a B. subtilis ã ư c nghiên c u y [7-10], nhưng vi c chuy n gen vào B. subtilis v n là v n nan gi i do vector chuy n gen vào B. subtilis v n chưa ư c thương m i hóa và òi h i m t s yêu c u c bi t có th cài nh p gen ích vào nhi m s c th c a vi khu n này. Theo nh ng thông tin mà chúng tôi có ư c, Vi t Nam m i ch có r t ít các công trình nghiên c u v bi u hi n gen trong B. subtilis như bi u hi n gen trên v bào t [11], ho c bi u hi n gen trong vi khu n này b ng cách s d ng ch t c m ng IPTG [12] và v n chưa có công trình nào nghiên c u bi u hi n gen trong t bào sinh dư ng c a vi sinh v t này mà không c n dùng ch t c m ng. Vì v y, trong 207<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> Tác gi liên h . T: 84-4-37547694. E-mail: uyennq@vnu.edu.vn<br /> <br /> 208<br /> <br /> N.Q. Uyển<br /> <br /> nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên<br /> <br /> Công nghệ 28 (2012) 207-214<br /> <br /> bài báo này chúng tôi bi u hi n gen mã hóa cho β-galactosidase như m t gen mô hình trong t bào sinh dư ng c a B. subtilis dư i s i u khi n c a promoter c a gen mã hoá cho rRNA (PrrnO).<br /> <br /> Môi trư ng LB cho nuôi c y E. coli DH5α, môi trư ng DSM nuôi c y các ch ng B. subtilis ư c mua t hãng Difco (USA). Các c p m i ư c s d ng (ph n g ch chân là v trí c t c a enzyme gi i h n): PrrnO-F-EcoRI:<br /> 5’-CCGGAATTCGCATGACCATTATGACTAG-3'<br /> <br /> 2. Nguyên li u và phương pháp 2.1. Các ch ng vi sinh v t, môi trư ng nuôi c y và c p m i s d ng:<br /> <br /> lacZ-R-HindIII:<br /> 5’-CCGAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG-3’<br /> <br /> Các ch ng ư c s d ng trong bài báo ư c trình bày trong b ng 1 dư i ây.<br /> B ng 1. Các ch ng vi sinh v t ư c s d ng trong bài báo Tên ch ng E. coli DH5α B. subtilis PY79 pUL1 pUL2 pUL3 pUL4 Ngu n g c Thương ph m Thương ph m ư c t o ra trong nghiên c u này ư c t o ra trong nghiên c u này ư c t o ra trong nghiên c u này ư c t o ra trong nghiên c u này c i m Bi n n p, nhân dòng và bi n i di truy n Dùng trong phòng thí nghi m, nhân dòng và bi n i di truy n E. coli DH5α ch a vector pUL1 mang o n chèn PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ E. coli DH5α ch a vector pDG364 mang o n chèn PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ Th bi n n p c a B. subtilis PY79 có o n PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ ư c cài nh p t i locus amyE trên nhi m s c th Th bi n n p c a B. subtilis PY79 có o n PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ ư c cài nh p t i locus amyE trên nhi m s c th<br /> <br /> 2.2. Phương pháp bi n n p vào vi khu n E. coli và B. subtilis: Phương pháp chu n b t bào kh bi n c a E. coli và bi n n p DNA vào vi khu n này ư c th c hi n theo tài li u tham kh o [13]. Phương pháp t o t bào kh bi n B. subtilis và bi n n p DNA vào t bào này ư c th c hi n theo tài li u tham kh o [14]. V n t t là, B. subtilis PY79 ư c nuôi n pha bão hòa trong môi trư ng SpC (T base có b sung glucose 50%, MgSO4 1.2%, bacto yeast extract 10%, casamino acid 1%) và sau ó ư c nuôi ti p trong môi trư ng SpII (thành ph n tương t SpC nhưng có b sung CaCl2 0.1M). Sau ó<br /> <br /> glycerol ư c b sung t n n ng cu i cùng là 10% và ư c chia vào các ng (200 µl/ ng), gi -80oC n khi s d ng. DNA sau khi b sung vào t bào kh bi n c a B. subtilis ã ư c làm rã ông, ư c l c t i 37oC trong 30-45 phút và ư c tr i trên các ĩa ch a môi trư ng kháng sinh sàng l c thích h p. 2.3. Phương pháp ki m tra s cài nh p và ánh giá ho t tính gen lacZ trong vi khu n B. subtilis Vector pDG 364 có ch a gen lacZ s ư c du i th ng b ng cách s d ng enzyme gi i h n PstI. Gen lacZ s ư c cài nh p theo phương pháp trao i chéo kép gi a gen amyE c a vector pDG364 (ch a hai ph n c a gen amyE,<br /> <br /> N.Q. Uyển<br /> <br /> nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên<br /> <br /> Công nghệ 28 (2012) 207-214<br /> <br /> 209<br /> <br /> và gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase gi a chúng, xem hình 1) và gen amyE trên nhi m s c th c a vi khu n B. subtilis nên th tái t h p mang gen lacZ cài nh p s ư c ki m tra theo hai tiêu chí: - Ki m tra kh năng kháng kháng sinh chloramphenicol: Sàng l c các th bi n n p trên môi trư ng có b sung chloramphenicol (50 µg/ml) l a ch n th tái t h p. - Ki m tra ho t tính amylase: Do trao i chéo kép, gen amyE b m t tính ngyên v n d n n m t ho t tính amylase. Do ó, th tái t h p không có kh năng phân gi i tinh b t. Nh d ch nuôi các th bi n n p trên ĩa th ch c l có b sung tinh b t (0.1%), 37oC trong 8h, nhu m ĩa b ng dung d ch lugol, các th bi n n p không có kh năng phân gi i tinh b t (không có vòng sáng trên ĩa) s ư c l a ch n.<br /> <br /> nitrophenol khi gi i phóng s chuy n h n h p ph n ng sang màu vàng và b h p th bư c sóng 420nm. M t ơn v ho t (U) βgalactosidase là lư ng enzyme c n thi t gi i phóng 1 µmol o-nitrophenol trong 1 phút 300C theo i u ki n thí nghi m. 1 ơn v (U) =<br /> OD420 *1000 (Thoi gian)* (Thê tích)*(OD600 )<br /> <br /> Trong ó: OD420: OD c a ph n ng màu o ư c t i 420 nm Th i gian: Th i gian ph n ng (phút) Th tích: Th tích d ch nuôi c y trong ph n ng (ml) OD600: M t t bào s d ng trong ph n ng ư c o t i 600 nm<br /> <br /> 2.4. M t s các quy trình thư ng quy s d ng trong tách dòng như tinh s ch plasmid, i n di ki m tra các s n ph m PCR, c t ki m tra o n gen chèn thêm trong plasmid… 3. K t qu và th o lu n 3.1. Tách dòng o n DNA bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ trong vector pUL1 Tách dòng o n DNA bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ ư c th c hi n ttheo sơ như hình 2.<br /> <br /> Hình 1. Cài nh p gen lacZ theo phương pháp trao i chéo kép vào nhi m s c th c a vi khu n B. subtilis.<br /> <br /> Ho t β-galactosidase ư c xác nh b ng cách cho enzyme này ph n ng v i cơ ch t t ng h p o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG). Dư i tác d ng c a β-galactosidase, ONPG s th y phân thành galactose và o-nitrophenol. o-<br /> <br /> Hình 2. Sơ tách dòng o n DNA bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ trong vector pUL1.<br /> <br /> 210<br /> <br /> N.Q. Uyển<br /> <br /> nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên<br /> <br /> Công nghệ 28 (2012) 207-214<br /> <br /> Vector pUL1 ư c cung c p t Phòng Công ngh Enzyme-Protein (Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c, HQGHN) có ch a promoter rrnO (PrrnO), RBS c a gen sspA. Gen lacZ ư c khu ch i thành công t khuôn pDG268 có ch a gen này (k t qu không trình bày ây). S n ph m PCR c a gen lacZ ( ư c c t v i BamHI và HindIII) ư c chèn vào<br /> <br /> vector pUL1 ( ã ư c x lý v i BamHI và HindIII) và bi n n p vào t bào kh bi n c a E. coli. Các th bi n n p ư c tr i trên môi trư ng ch n l c ch a kanamycin (30 µg/ml). Plasmid các khu n l c thu ư c c t v i enzyme gi i h n BamHI và HindIII ki m tra o n DNA ư c chèn. K t qu c t plamid pUL1 có ch a gen lacZ chèn thêm ư c th hi n trong hình 3.<br /> <br /> Hình 3. K t qu c t plamid pUL1 có ch a gen lacZ chèn thêm. 1: s n ph m PCR có kích thư c 3 kb, plamid pUL1 có ch a gen lacZ chèn thêm, M: DNA marker (Express DNA ladder).<br /> <br /> K t qu cho th y sau khi c t b i enzyme gi i h n, plasmid này văng ra m t băng có kích thư c 3 kb úng như d oán. i u này ch ng t chúng tôi ã nhân dòng thành công gen lacZ trong vector pUL1.<br /> <br /> 3.2. Tách dòng o n ADN bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ trong vector pDG364 Tách dòng o n DNA bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ trong vector pDG364 ư c th c hi n theo sơ như hình 4.<br /> <br /> N.Q. Uyển<br /> <br /> nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên<br /> <br /> Công nghệ 28 (2012) 207-214<br /> <br /> 211<br /> <br /> EcoRI HindIII<br /> <br /> Hình 4. Sơ<br /> <br /> tách dòng o n ADN bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ trong vector pDG364.<br /> <br /> o n DNA bao g m promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ ư c khu ch i thành công t pUL1 có ch a gen lacZ b ng cách s d ng c p m i như trong ph n „Nguyên li u và Phương pháp“ (k t qu không trình bày ây). S n ph m PCR c a gen lacZ ( ư c c t v i EcoRI và HindIII) ư c chèn vào vector pDG364 ( ã ư c x lý v i EcoRI và HindIII) và bi n n p vào t bào kh bi n c a E. coli. Các th bi n n p ư c tr i trên môi trư ng ch n l c ch a ampicillin (50 µg/ml). Các khu n l c thu ư c tách plasmid c t v i enzyme gi i h n EcoRI và HindIII ki m tra o n DNA ư c chèn. K t qu c t plamid pUL2 có ch a promoter PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ chèn thêm ư c th hi n trong hình 5.<br /> <br /> Hình 5. C t ki m tra plamid pUL2 có ch a o n DNA g m PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ. 1: s n ph m PCR có kích thư c 3 kb, plamid pUL2 có ch a o n PrrnO-RBS c a gen sspA-lacZ, M: DNA marker (Express DNA ladder).<br /> <br />