Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen coat protein của virus SMV và BYMV

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135<br /> <br /> THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi<br /> CHỨA VÙNG GEN COAT PROTEIN CỦA VIRUS SMV VÀ BYMV<br /> Lò Thị Mai Thu1, Phạm Thanh Tùng2, Lê Văn Sơn2,<br /> Chu Hoàng Hà2, Chu Hoàng Mậu3*<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Tây Bắc<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam<br /> 3<br /> Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên; *mauchdhtn@gmail.com<br /> 2<br /> <br /> TÓM TẮT: SMV và BYMV là hai loại virus điển hình gây bệnh khảm lá ở đậu tương, hiện nay, trong<br /> ngành sản xuất đậu tương mới dừng lại ở các biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị hai loại virus này.<br /> RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật, tính<br /> hiệu quả của kỹ thuật RNAi thể hiện ở việc tạo cây trồng kháng virus bằng cách chuyển các gen có nguồn<br /> gốc từ chính virus gây bệnh. Với mục đích cải thiện khả năng kháng virus SMV và BYMV của cây đậu<br /> tương Việt Nam bằng kỹ thuật chuyển gen, trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả thiết kế<br /> vector chuyển gen (pGWSMV-BYMV-CPi) mang cấu trúc RNAi-CPi của SMV và BYMV. Đoạn CPi là<br /> trình tự bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV có kích thước 573 bp. Tạo được dòng vi khuẩn A.<br /> umefaciens mang cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi sử dụng để lây nhiễm vào mô tổn thương nách lá mầm<br /> nhằm tạo các dòng cây đậu tương chuyển gen kháng virus SMV và BYMV.<br /> Từ khóa: Bệnh khảm lá, BYMV, đậu tương, gen CP, SMV.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Kết quả điều tra về bệnh trên cây trồng ở<br /> Việt Nam đã xác định được 20 loại bệnh hại,<br /> trong đó, các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn<br /> thất lớn cho năng suất đậu tương và hiện nay<br /> vẫn chưa có biện pháp phòng trừ hiệu quả các<br /> bệnh do virus. Đậu tương là một trong số các<br /> cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh<br /> khảm (soybean mosaic virus-SMV), bệnh khảm<br /> vàng (bean yellow mosaic virus-BYMV), bệnh<br /> xoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác. Vì<br /> vậy, nghiên cứu tạo cây đậu tương kháng virus<br /> phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương sạch<br /> bệnh là rất cần thiết.<br /> SMV và BYMV thuộc chi Potyvirus, họ<br /> Potyviridae. Hệ gen của SMV và BYMV bao<br /> gồm các gen trên sợi RNA (+). Bệnh khảm lá<br /> do SMV và BYMV là một trong những bệnh<br /> virus điển hình nhất ở đậu tương, làm giảm<br /> năng suất và chất lượng của hạt đậu tương.<br /> SMV và BYMV lan truyền do rệp làm môi giới<br /> và sự lan truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ do<br /> rệp ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu. Hiện nay trong<br /> ngành sản xuất đậu tương mới dừng ở các biện<br /> pháp phòng mà chưa có thuốc trị hai loại virus<br /> này. Đó là chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống,<br /> vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu<br /> <br /> dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng và diệt trừ<br /> côn trùng truyền bệnh. Các biện pháp truyền<br /> thống thường phức tạp, tốn thời gian, hiệu quả<br /> không cao và kém bền vững. RNAi được xem là<br /> một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các<br /> bệnh do virus gây ra ở thực vật. Tính hiệu quả<br /> của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng<br /> kháng virus bằng cách chuyển các gen có nguồn<br /> gốc từ chính virus gây bệnh [1, 2, 3] và khẳng<br /> định sự kết hợp với kỹ thuật chuyển gen là biện<br /> pháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việc<br /> cải thiện và tăng cương khả năng kháng virus ở<br /> cây trồng [12]. Trong bài báo này, chúng tôi<br /> trình bày kết quả thiết kế cấu trúc vector RNAi<br /> mang đoạn gen coat protein (CP) của SMV và<br /> BYMV nhằm phục vụ tạo cây đậu tương<br /> chuyển gen kháng virus.<br /> VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Vùng gen CPi của SMV và BYMV có ký<br /> hiệu SMV-BYMV-CPi với kích thước 573<br /> nucleotide được thiết kế bao gồm đoạn bảo thủ<br /> của gen CP ở SMV và BYMV dựa trên phân<br /> tích đoạn gen CP của SMV và BYMV đã phân<br /> lập và các trình tự được công bố trên Gen Bank.<br /> 129<br /> <br /> Lo Thi Mai Thu et al.<br /> <br /> Cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R cho<br /> PCR nhân bản đoạn CPi được thiết kế có trình<br /> tự: SMV-CPi-F: 5’- caccgcagcagaagcttaca -3’<br /> và BYMV-CPi-R: 5’- atgttccgaaccccaagcaa -3’.<br /> Vector chuyển gen pK7GWIWG2(II), bộ kit<br /> nhân dòng pENTRTM Directional TOPO®<br /> Cloning Kit (Invitrogen), bộ kit thực hiện phản<br /> ứng Gateway Gateway® LR ClonaseTM II.<br /> Chủng vi khuẩn E. coli One Shot® TOP 10<br /> (Invitrogen), E. coli DH5α và chủng<br /> A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc<br /> pGV2660.<br /> Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang<br /> cấu trúc RNAi<br /> Kỹ thuật Gateway (Invitrogen, Karlsruhe,<br /> Germany) được sử dụng để tạo cấu trúc RNAi<br /> dựa trên nguyên lý trao đổi chéo đặc hiệu vị trí<br /> của phage λ.<br /> Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang<br /> cấu trúc RNAi được thực hiện theo mô tả của<br /> Karimi et al. (2002) [5] (hình 1).<br /> <br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng<br /> GeneJET PCR Purification Kit của hãng<br /> Thermo Scientific. Sau khi tinh sạch, đoạn gen<br /> CPi tiếp tục được dòng hóa vào vector<br /> pENTRY/D để tạo ra dòng entry pENTR/D<br /> mang CPi (kí hiệu pEN-CPi) có chứa các vị trí<br /> tái tổ hợp attL. Đây là vị trí sẽ tái tổ hợp với<br /> attR trên pK7WIWG2(II) khi có sự xúc tác của<br /> enzyme đặc hiệu. Tiếp đó phản ứng LR (phản<br /> ứng xảy ra sự tái tổ hợp giữa các vị trí attL và<br /> attR được xúc tác bởi enzyme LR ClonaseTMII)<br /> được thực hiện giữa vector pEN-CPi với vector<br /> nhận destination pK7WIWG2(II). Kết quả sẽ<br /> tạo được vector nhị thể biểu hiện ở thực vật<br /> mang cấu trúc RNAi với hai vị trí chèn đoạn<br /> gen đưa vào theo chiều sene và antiense được<br /> ngăn cách bởi một đoạn intron dưới sự điều<br /> khiển của promoter CaMV35S (ký hiệu:<br /> pGWSMV-BYMV-CPi). Cấu trúc pGWSMVBYMV-CPi được dòng hóa trong tế bào E. coli<br /> DH5α. Chọn lọc các khuẩn lạc dương tính trên<br /> môi trường LB bổ sung các kháng sinh<br /> streptomycin 40 mg/l, Spectinomycin 100 mg/l<br /> và Chloramphenicol 50 mg/l. Sau khi chọn<br /> dòng trong tế bào E. coli bởi phản ứng colonyPCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Tách chiết plasmid<br /> pGWSMV-BYMV-CPi và cấu trúc pGWSMVBYMV-CPi được biến nạp vào tế bào A.<br /> tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260 bằng<br /> phương pháp xung điện. Trước khi biến nạp<br /> vector tái tổ hợp pGWSMV-BYMV-CPi vào tế<br /> bào A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây<br /> độc pGV2260 bằng phương pháp xung điện, tế<br /> bào này được làm cho khả biến theo Sambrook<br /> et al. (1998) [8].<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ mô tả các bước thiết kế vector<br /> mang cấu trúc RNAi bằng kỹ thuật Gateway<br /> Để thiết kế cấu trúc RNAi mang đoạn CPi<br /> của SMV và BYMV (SMV-BYMV-CPi), đầu<br /> tiên đoạn CPi được nhân lên bằng phản ứng<br /> PCR với thành phần phản ứng gồm: 2,5 µl pfu<br /> Buffer with MgSO4 10X, 0,5 µl taq Pfu, 2,5 µl<br /> dNTPs, 0,5 µl mồi mỗi loại (SMV-CPiF/BYMV-CPi-R), 0,5 µl mẫu plasmid và 17<br /> H2O2. Chu kỳ nhiệt của PCR là: 95oC/3 phút; 30<br /> chu kỳ (95oC/30 giây, 54oC/30 giây, 72oC/1phút<br /> 30 giây); 72oC/7 phút; mẫu được giữ ở 4oC.<br /> 130<br /> <br /> Khuếch đại vùng CPi thuộc gen CP của SMV<br /> và BYMV<br /> Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi<br /> đơn và sự ức chế RNA ngoại lai bằng cơ chế<br /> RNAi chỉ xảy ra khi có sự tương đồng cao giữa<br /> các siRNA và gen đích (RNA của virus). Mặt<br /> khác, hiệu quả kháng virus của cây chuyển gen<br /> phụ thuộc rất nhiều vào vai trò và chức năng<br /> gen của virus cần phân hủy, vì vậy lựa chọn<br /> vùng gen nào để thiết kế cấu trúc RNAi được<br /> cho là khâu quan trọng đưa đến sự thành công<br /> kỹ thuật RNAi. Căn cứ vào trình tự gen CP<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135<br /> <br /> phân lập được từ một số dòng virus SMV tại<br /> Sơn La và các thông tin về trình tự gen CP,<br /> trình tự amino acid suy diễn của gen CP phân<br /> lập từ SMV và BYMV đã công bố trên Ngân<br /> hàng gen quốc tế, sử dụng BLAST trong NCBI<br /> vùng bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV đã<br /> được xác định. Vùng cấu trúc RNAi (CPi) đã<br /> được lựa chọn, thiết kế và tổng hợp nhân tạo<br /> làm nguyên liệu để thiết kế vector mang cấu<br /> trúc RNAi.<br /> Khuếch đại vùng CPi từ đoạn gen nhân tạo<br /> bằng PCR với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMVCPi-R và sản phẩm được điện di trên gel<br /> agarose 1%, kết quả thu được đoạn CPi có kích<br /> thước như thiết kế là 0,573 kb (hình 2).<br /> Vùng SMV-BYMV-CPi được thiết kế bao<br /> gồm trình tự thuộc vùng bảo thủ gen CP của cả<br /> hai loài virus SMV và BYMV. Trình tự đoạn<br /> SMV-BYMV-CPi gồm 573 nucleotide được<br /> trình bày ở hình 3.<br /> <br /> M<br /> <br /> CPi<br /> <br /> 1,0 kb<br /> 0,5 kb<br /> <br /> 0,573 kb<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng<br /> CPi của SMV và BYMV<br /> M. thang DNA 1 kb; CPi.trình tự vùng bảo thủ<br /> CPi khuếch đại từ đoạn CP nhân tạo.<br /> <br /> Hình 3. Trình tự đoạn SMV-BYMV-CPi của virus SMV và BYMV<br /> Tạo dòng vector chuyển gen pGWSMVBYMV-CPi trong tế bào E. coli DH5α và tạo<br /> chủng vi khuẩn A. Tumefaciens mang cấu trúc<br /> RNAi<br /> Sản phẩm PCR CPi được làm sạch bằng Kit<br /> <br /> GeneJET PCR Purification của hãng Thermo<br /> Scientific và được gắn vào vector pENTR theo<br /> bộ Kit pENTR™/D-TOPO® tạo plasmid tái tổ<br /> hợp có mang vùng CPi pENSMV-BYMV-CPi<br /> và biến nạp vào E. coli One Shop® TOP 10.<br /> <br /> 131<br /> <br /> Lo Thi Mai Thu et al.<br /> <br /> Kiểm tra khuẩn lạc bằng colony-PCR với cặp<br /> mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R, kết<br /> quả thu được thể hiện ở hình 3A. Lựa chọn một<br /> dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng<br /> colony-PCR, nuôi và tách chiết plasmid phục vụ<br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> cho việc đọc trình tự và thí nghiệm tiếp theo.<br /> Kết quả xác định trình tự chứng tỏ đoạn gen<br /> quan tâm CPi đã được nhân dòng, ghép nối<br /> thành công tạo vector tái tổ hợp pENSMVBYMV-CPi (hình 4B).<br /> 1<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> 2<br /> <br /> 2 kb<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> M<br /> M<br /> <br /> 3 kb<br /> 2 kb<br /> <br /> 0,5 kb<br /> <br /> Hình 4. A. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc (M. thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 3,<br /> 4: vùng CPi khuếch đại từ khuẩn lạc); B. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pENSMVBYMV-CPi (M. thang DNA 1kb; 1-2: plasmid tách từ hai dòng khuẩn lạc)<br /> Plasmid pENSMV-BYMV-CPi tiếp tục<br /> tham gia phản ứng LR với pK7GWIWG2(II) để<br /> tạo vector chuyển gen nhị thể mang CPi<br /> (pGWSMV-BYMV-CPi) và dòng hóa vào tế<br /> bào khả biến E. coli DH5α. Để chọn được dòng<br /> khuẩn lạc mong muốn, phản ứng colony-PCR<br /> đã được thực hiện.<br /> Kết quả colony-PCR đã thu được các dòng<br /> <br /> khuẩn lạc dương tính mang vector pGWSMVBYMV-CPi với các đoạn gen lặp lại đảo chiều<br /> được ngăn cách bởi một đoạn intron ở giữa dưới<br /> sự điều khiển của promoter CaMV35S (Hình 5).<br /> Cấu trúc này sẽ tạo ra dạng kẹp tóc RNA sau<br /> khi được chuyển vào cây trồng và sẽ khởi sự cơ<br /> chế RNAi để kháng lại các RNA của virus<br /> ngoại lai có trình tự tương đồng.<br /> <br /> X baI<br /> <br /> Hình 5. Sơ đồ cấu trúc pGW/gene: P35S, Promoter CaMV35S; att1 và attB2, các vị trí tái tổ hợp<br /> trong phản ứng LR; LB, left T-DNA border; RB, right T-DNA border; T35S, terminator 35S; Kan,<br /> gen kháng kanamycin; CmR, gen kháng chloramphenicol; Gene, vị trí các đoạn gen chèn vào; vị trí<br /> cắt giới hạn của các enzyme tương ứng; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám mồi tương ứng.<br /> Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản<br /> ứng colony-PCR được sử dụng tách chiết<br /> plasmid tái tổ hợp pGWSMV-BYMV-CPi. Sau<br /> khi tách chiết vector mang cấu trúc pGWSMV132<br /> <br /> BYMV-CPi được biến nạp vào tế bào vi khuẩn<br /> A. tumefaciens và tiếp tục chọn dòng bằng phản<br /> ứng colony-PCR với cặp mồi<br /> SMV-CPiF/BYMV-CPi-R, kết quả được thể hiện ở hình 6.<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> M<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 5kb<br /> 2kb<br /> 0,5kb<br /> <br /> Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc A. tumefaciens<br /> M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: Sản phẩm PCR của 10 dòng khuẩn lạc.<br /> Kết quả ở hình 6 cho thấy, một băng DNA<br /> có kích thước lớn hơn 0,5 kb đúng bằng kích<br /> thước của đoạn SMV-BYMV-CPi. Những dòng<br /> A. tumefaciens sau khi kiểm tra được lưu giữ<br /> trong glycerol ở -84oC để phục vụ chuyển gen<br /> tạo cây đậu tương kháng virus sau này.<br /> Trong nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có<br /> chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều<br /> thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ<br /> được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc<br /> (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ<br /> đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự<br /> xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận<br /> thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp<br /> lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả<br /> ihpRNA tạo ra sự câm gen là cao nhất [9, 10].<br /> Kenny et al. (2007) [6] đã tạo ra được một dòng<br /> cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean<br /> golden mosaic virus) với tính kháng lên đến<br /> 93%. Lim et al. (2007) [7] nghiên cứu chuyển<br /> gen HC-pro vào cây đậu tương đã nhận thấy<br /> rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau<br /> 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm lá do SMV<br /> biến mất và lượng SMV đã giảm đáng kể, tuy<br /> nhiên HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình<br /> thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tương<br /> chuyển gen. Nhìn chung, hầu hết các cây<br /> chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm<br /> chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh. Tuy<br /> nhiên, tính kháng bệnh của cây trồng còn phụ<br /> thuộc nhiều vào chức năng và vị trí gen chuyển.<br /> Ở Việt Nam, thành công đầu tiên tạo cây<br /> thuốc lá chuyển gen kháng CMV (cucumber<br /> mosaic virus) và TMV (tobacco mosaic virus)<br /> bằng kỹ thuật RNAi. Những dòng thuốc lá<br /> chuyển đoạn gen ghép nối mang đồng thời gen<br /> <br /> CP của TMV và CMV đã cho thấy hiệu quả<br /> kháng lên tới 60% đối với hai chủng virus này.<br /> Các cây biểu hiện khả năng kháng cao sau 3 lần<br /> lây nhiễm đồng thời 2 chủng virus đã cho thấy<br /> khả năng kháng bệnh được duy trì cho thế hệ<br /> sau [11]. Tiếp đến thành công ở đu đủ kháng<br /> bệnh đốm vòng do virus PRSV (papaya ringspot<br /> virus) [4, 13]. Tuy nhiên, các nhóm tác giả cũng<br /> thấy rằng tỷ lệ kháng bệnh của các dòng cây<br /> chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được<br /> lựa chọn để thiết kế vector. Bệnh khảm lá đậu<br /> tương do SMV và BYMV có triệu trứng khó<br /> phân biệt, cây đậu tương có thể chỉ bị nhiễm<br /> một loại virus SMV hoặc BYMV và cũng có thể<br /> nhiễm đồng thời cả hai loại virus này. Chính vì<br /> vậy chúng tôi thiết kế vector mang vùng bảo thủ<br /> của gen CP của cả hai loài virus SMV và<br /> BYMV với mong muốn tạo cây đậu tương<br /> chuyển gen kháng được cả hai loài virus này.<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Đã thiết kế thành công vector chuyển gen<br /> (pGWSMV-BYMV-CPi) mang cấu trúc RNAiCPi. Đoạn CPi là trình tự bảo thủ của gen CP ở<br /> SMV và BYMV được thiết kế có kích thước<br /> 573bp. Tạo được dòng vi khuẩn A. tumefaciens<br /> mang cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi sử dụng<br /> để lây nhiễm vào mô tổn thương nách lá mầm<br /> nhằm tạo các dòng cây đậu tương chuyển gen<br /> kháng SMV và BYMV.<br /> Lời cảm ơn: Nghiên cứu được hoàn thành có<br /> sử dụng thiết bị Phòng ADN&Ứng dụng,<br /> Phòng thí nghiệm Trọng điểm về công nghệ<br /> gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm<br /> Khoa học và Công nghệ Việt Nam và thuộc nội<br /> dung của đề tài Khoa học-Công nghệ cấp Bộ<br /> 133<br /> <br />