Thực tập Vi sinh vật học: Phần 2 - Đàm Sao Mai

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:86

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thực tập Vi sinh vật học gồm 26 bài, mỗi bài đều có phần nhắc lại lí thuyết trọng tâm, giúp người đọc nắm được cơ sở lí thuyết của thí nghiệm. Trình tự thao tác được trình bày cặn kẽ, hợp lí và minh họa rõ ràng. Các bài thí nghiệm thực hiện qua nhiều công đoạn đều có sơ đồ trình tự thí nghiệm, giúp người đọc hình dung rõ ràng tiến trình thí nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 2 dưới đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thực tập Vi sinh vật học: Phần 2 - Đàm Sao Mai

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 107 Bài 14 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC I. NGUYÊN TẮC Tổng vi khuẩn hiếu khí là tổng số các loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong môi trường. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhóm vi khuẩn này cần oxy cho quá trình hô hấp hiếu khí để chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động của chúng. Các nhóm vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong môi trường nước chúng sẽ phân giải tích cực các hợp chất hữu cơ tạo thành những sản phẩm cuối cùng là CO2 và giải phóng ATP. Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một trong những tiêu chí để đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm của thực phẩm. Và hầu như trong tất cả các loại thực phẩm, nước uống, khi phân tích chất lượng vi sinh vật, chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí là bắt buộc phải phân tích. Các bộ tiêu chuẩn về thực phẩm, nước uống luôn có mức giới hạn O cho tiêu chuẩn này. Ví dụ: theo tiêu chuẩn TCVN 7046 : 2002 giành cho sản phẩm thịt tươi, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí là: 106 khuẩn lạc/1g thịt. Nếu vượt quá giới hạn, R thực phẩm được xem là không an toàn cho người sử dụng. Tổng số các nhóm vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thực phẩm có thể được xác định bằng IG phương pháp nuôi cấy trải trên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ. Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri cho phép xác định được lượng vi sinh vật sống còn khả năng sinh trưởng trong mẫu ban đầu. Phương pháp định lượng này dựa IN trên nguyên tắc: một vi sinh sống, trên môi trường dinh dưỡng, sau một khoảng thời gian xác định sẽ phát triển và hình thành nên một khuẩn lạc. A Tuy nhiên, để kết quả đếm chính xác nhất, số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri phải trong giới hạn nhất định. Ví dụ, nếu lượng mẫu cấy vào đĩa là 1 ml thì số lượng khuẩn lạc L vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250 khuẩn lạc, đối với nấm mốc là 30-50 khuẩn lạc... Nếu số lượng vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha loãng lớn hơn. II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT 1. Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng Ghi chú nhóm (3 sinh viên) 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm ‫׎‬18 Cái 6 3 Bình tam giác 250 ml Cái 1 4 Cốc 100 ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1
108 Thực tập Vi sinh vật học Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng Ghi chú nhóm (3 sinh viên) 6 Pipette 1 ml Cái 5 7 Pipette 10 ml Cái 1 8 Que trải Cái 1 9 Đèn cồn Cái 1 10 Que cấy Cái 1 Dụng cụ dùng chung 11 Nồi hấp cao áp Cái 1 12 Tủ cấy vô trùng Cái 1 13 Tủ sấy Cái 1 14 Máy dập mẫu Cái 1 15 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 16 Tủ ấm Cái 1 2. Môi trường và hoá chất O - Môi trường Plate count agar (PCA) + Casein peptone: 5,0 g R + Cao nấm men: 2,5 g IG + Dextrose: 1,0 g + Agar: 15,0 g + Nước cất đủ 1000 ml IN Cân đầy đủ các thành phần môi trường, phối trộn, điều chỉnh pH = 7,0 ± 0,2. Nấu sôi nhẹ cho tan agar. Phân phối môi trường vào bình tam giác. Hấp tiệt trùng ở 121oC/20 A phút, để ấm (45-50oC) phân phối vào các đĩa petri. L - Nước muối sinh lý 0,9% - Nước cất vô trùng - Cồn 96o 3. Nguyên liệu khác - Nước mía - Thịt tươi - Túi nilon dập mẫu III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Lấy mẫu - Tùy theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 109 - Quá trình lấy mẫu có những yêu cầu sau: + Lấy các mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ. + Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng. + Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, không được để quá 24 giờ. + Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu. 2. Pha loãng mẫu - Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước peptone 1,0% vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9 ml nước muối hoặc nước peptone vô trùng và một số pipette 1 ml vô trùng. * Với mẫu ở dạng lỏng - Hút 1 ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý vô trùng. Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3 - 5 lần. Ta được độ pha loãng O 1/10 hay 10-1. - Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý R vô trùng thứ 2. Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3 - 5 lần. Ta được độ pha loãng 1/100 hay 10-2. IG - Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4 ta sẽ có được các độ pha loãng tương ứng 10-3, 10-4. IN A L Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) Tỉ lệ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Độ pha loãng 101 102 103 104 105 Độ pha loãng cuối Hình 14.1. Phương pháp pha loãng bậc 10 dung dịch huyền phù (pha loãng thập phân)
110 Thực tập Vi sinh vật học * Với mẫu ở dạng đặc Chuẩn bị hai bình tam giác có dung tích 250 ml: - Bình 1 chứa 90 ml nước muối sinh lý hoặc nước peptone 1,0% vô trùng. - Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì cả. - Cho một ít cồn vào cối chày sứ và đốt lên để khử trùng. Để nguội. - Cân 10 g mẫu, cho vào cối chày sứ, nghiền nát mẫu hoặc đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu với máy dập mẫu. - Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển mẫu sang bình 2. Lắc 5 phút. - Để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trong trường hợp mẫu ở trạng thái lỏng. - Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít. - Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định số lượng vi sinh vật. 3. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên O môi trường thạch (ISO 4833:1991) R a) Nguyên tắc - Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng IG trên hộp petri. - Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian IN nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào. b) Cách cấy mẫu Cấy theo phương pháp tạo hộp đổ A - Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4 , 10-5 để cấy mẫu. L - Ghi vào nắp hộp petri có môi trường thạch các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy - Dùng pipette đã vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa petri (đã vô trùng). - Cho khoảng 15ml môi trường PCA ở nhiệt độ khoảng 45oC vào hộp petri. Xoay chậm cho hỗn hợp trộn đều. Để yên cho nguội. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30oC trong 72 giờ. - Mỗi mẫu cấy ba nồng độ. Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri. - Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 111 1 ml Dung dịch mẫu đã 45oC pha loãng PCA 10 -15 ml Đĩa petri vô Lắc đều đĩa petri trùng Lật ngược đĩa Để nguội Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và O tính kết quả R Hình 14.2. Quy trình tạo hộp đổ Phương pháp cấy bề mặt IG - Dịch huyền phù được chuẩn bị tương tự như phương pháp tạo hộp đổ. - Môi trường PCA sau khi hấp tiệt trùng, được làm nguội đến khoảng 50-60oC sau IN đó đổ vào đĩa petri vô trùng. - Đĩa petri chứa môi trường được làm khô bề mặt bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 35 C hoặc chuẩn bị trước 2 ngày. o A - Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hoặc 0,3 ml nhỏ lên bề mặt môi trường L trong đĩa petri. - Trải đều dung dịch vi sinh vật lên bề mặt môi trường bằng que trải tam giác thủy tinh. - Các đĩa petri được để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô bề mặt. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30oC trong 72 giờ. - Mỗi mẫu cấy ba nồng độ. Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri. - Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.
112 Thực tập Vi sinh vật học Hình 14.3. Phương pháp cấy trải bề mặt c) Cách đếm - Lấy bút chì kẻ hai đường vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I, II, III, IV. - Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng. Nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm. O - Số lượng tế bào trong một gram mẫu được tính theo công thức sau đây: ∑C R N (CFU / ghayCFU / ml ) = (n1vd1 + ... + ni vd i ) IG với : N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu (CFU: colony forming units); IN C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa); A ni : số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ I; L di: hệ số pha loãng tương ứng; v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. Ví dụ: trong một trường hợp phân tích 1 g mẫu cụ thể nhận được kết quả sau: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 Kết quả hộp petri 1 235 26 hộp petri 2 246 36 hộp petri 3 198 17 - Số khuẩn lạc có trong mẫu là: 235 + 246 + 198 + 26 + 36 660 N= −3 −4 = = 2.3x10 5 (CFU / ml ) 3x1x10 + 2 x1x10 0,033
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 113 - Vậy số lượng khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu hoặc trong 1 gam mẫu (CFU/g hay CFU/ml) là 2.3x105 * Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc có trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 15 ta tính như sau: - Gọi m là lượng khuẩn lạc trung bình có trên hai hộp petri - Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: NE = m/ml - Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1 gam mẫu sẽ là: NE = mxd-k, với d là hệ số pha loãng. * Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 1 tính như sau: - Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: NE nhỏ hơn 1/ml - Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1 gam mẫu sẽ là: NE nhỏ hơn 1xd-k, với d là hệ số pha loãng Chú ý: Độ pha loãng thích hợp nhất nếu ở nồng độ này cấy trên thạch đĩa cho số O khuẩn lạc trung bình từ 50 - 150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30 - 50 với nấm. R IG IN A Bút đếm khuẩn lạc Bàn đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự động L Hình 14.4. Các loại dụng cụ đếm khuẩn lạc IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Khi tiến hành pha loãng mẫu, các dung dịch phải được hút đúng thể tích yêu cầu. - Đối với phương pháp tạo hộp đổ, môi trường nuôi cấy sau khi hấp tiệt trùng phải được làm nguội đến 45-50oC bằng bể ổn nhiệt trước khi đổ vào đĩa petri chứa dung dịch vi sinh vật. - Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải được lật úp trước khi nuôi ủ để tránh các khuẩn lạc ở bề mặt mọc loang. - Trong quá trình đếm khuẩn lạc, không được mở hộp petri. - Que trải thủy tinh dùng để trải dung dịch vi sinh vật được khử trùng bằng cách nhúng vào cồn 96o rồi đốt, không được hơ trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.
114 Thực tập Vi sinh vật học V. BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. - So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp tạo hộp đổ và phương pháp cấy trải bề mặt. - Tính số CFU/ml mẫu nước ban đầu. SƠ ĐỒ KIỂM NGHIỆM TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Tiêu chuẩn áp dụng: ISO 4833: 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizonrtal method for the enumeration of microorganisms Colony – count technique at 30oC Mẫu Đồng nhất mẫu O Đồng nhất 10 g mẫu trong 90 ml nước muối 0,85% R IG Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1,10-2,10-3... IN Cấy mẫu A Chọn ba nồng độ pha loãng thích hợp L Phương pháp đổ đĩa Phương pháp cấy trải Cấy 1 ml mẫu vào đĩa petri vô trùng Cấy 0,1 ml mẫu vào môi trường thạch (mỗi nồng độ cấy hai đĩa), đổ vào mỗi PCA, dùng que cấy dàn đều mẫu đĩa 12-15 ml PCA đã làm nguội 44 -47oC, trên mặt thạch, ủ 30oC/72giờ lắc đều, ủ 30oC/72giờ Tính kết quả Chọn đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 15 - 300/ đĩa để đếm
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 115 Bài 15 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) I. NGUYÊN TẮC Từ coliform được Blachstein sử dụng đầu tiên vào năm 1893 để nói về những vi khuẩn bacilli có đặc điểm hình thái giống E. coli. Coliform là những trực khuẩn, Gram (-), không sinh bào tử, hô hấp tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24-48 giờ. Nhóm coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Số lượng coliforms trong mẫu được dùng để chỉ thị khả năng có mặt của các vi sinh vật gây bệnh khác, chỉ thị cho mức độ an toàn vệ sinh của một môi trường hay một sản phẩm. Nhóm coliforms gồm bốn giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E. coli; Citrobacter; Klebsiella và Enterobacter. Coliform chịu nhiệt là những coliform có khả năng lên men lactose sinh hơi khi ủ ở 44 C/24 giờ trong môi trường EC. Coliform phân (Faecal Coliform hay E. coli giả định) là o O coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ ở 44.5oC trong 24 giờ trong tryptone. E. coli có mặt rất nhiều trong phân người và động vật. Trong phân tươi, đậm độ của R chúng có thể đến 109/g. Chúng được tìm thấy trong nước cống rãnh, trong các công đoạn xử lý và trong tất cả các nguồn nước và đất vừa mới bị nhiễm phân từ người, động vật hoặc IG do sản xuất nông nghiệp. Gần đây người ta đã nghĩ đến E. coli có thể tồn tại hoặc thậm chí phát triển trong những nguồn nước ở vùng nhiệt đới không phải là đối tượng bị ô nhiễm phân. Từ phân, coliform có thể xâm nhiễm trực tiếp vào thực phẩm trong các công đoạn IN chế biến, canh tác hoặc phân phối. A L Hình 15.1. Cấu trúc nhóm coliforms
116 Thực tập Vi sinh vật học Nhóm coliform trong thực phẩm có thể được xác bằng phương pháp MPN. Phương pháp MPN (phương pháp có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất có mặt trong một đơn vị thể tích mẫu hay nói cách khác phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại ba lần ở ba độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 9 ống nghiệm. Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính. Từ kết quả của các thí nghiệm định tính, dựa vào bảng Mac Crady để suy ra mật độ ước đoán số lượng vi sinh vật có trong mẫu, được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml hay số MPN/g mẫu. Độ chính xác của phương pháp MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn. Có hai hệ thống MPN: hệ thống 9 ống và hệ thống 15 ống. O Phương pháp MPN có đặc điểm: R - Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như IG + Sự tạo hơi: Coliform … + Sự đổi màu: S. aureus IN - Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn. II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT A 1. Dụng cụ L Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng nhóm (3 sinh viên) 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm ‫׎‬18 Cái 15 3 Bình tam giác 250 ml Cái 1 4 Cốc 100 ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1 ml Cái 5 7 Pipette 10 ml Cái 1 8 Que trải Cái 1 9 Đèn cồn Cái 1 10 Ống Durham ống 9 11 Que cấy Cái 1
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 117 Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng nhóm (3 sinh viên) Dụng cụ dùng chung 12 Nồi hấp cao áp Cái 1 13 Tủ cấy vô trùng Cái 1 14 Tủ sấy Cái 1 15 Máy dập mẫu Cái 1 16 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 17 Tủ ấm Cái 1 2. Môi trường và hóa chất - Môi trường BGBL + Peptone: 10 g + Lactose:10 g + Oxgall: 20 g O + Brilliant green: 0,0133 g + Nước cất: đủ 1000 ml R Điều chế: Cân 40 g bột môi trường BGBL, bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml, IG khuấy đều. Phân phối vào các dụng cụ chứa. Đặt ống Durham vào môi trường. Đem hấp o khử khuẩn ở 121 C (1atm)/15 – 20 phút. pH: 7,7± 0,1 - Nước muối sinh lý 0,9% IN - Nước cất vô trùng - Cồn 96o A 3. Nguyên liệu khác L - Thịt tươi, mẫu nước thải - Túi nilon dập mẫu III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Lấy mẫu phân tích - Mẫu thực phẩm từ các cơ sở chế biến được lấy theo tiêu chuẩn ISO: 5667 hoặc TCVN 5994:1995. - Các dụng cụ chứa mẫu được bảo quản ở 4oC trong thời gian ngắn (6-8 giờ) và ở - 20oC trong thời gian dài (không quá 36 giờ). Tránh ánh sáng trực tiếp. - Trước khi phân tích, các mẫu nước bảo quản lạnh đông phải được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng hoặc ở nhiệt độ 45oC trong 15 phút.
118 Thực tập Vi sinh vật học 2. Chuẩn bị mẫu phân tích - Nếu là mẫu lỏng, lắc nhẹ bình mẫu, dùng pipette vô trùng, hút chính xác 10 ml dung dịch mẫu cho vào một bình tam giác có chứa sẵn 90 ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1%. Nếu là mẫu rắn, dùng đĩa cân, kẹp inox vô trùng cân chính xác 10 g mẫu cho vào một bình tam giác có chứa sẵn 90 ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1%. - Lắc đều bình tam giác để hòa đều mẫu, ta được độ pha loãng 10-1. Nếu là mẫu rắn, tiến hành dập mẫu bằng máy dập. - Tiến hành pha loãng mẫu tiếp tục theo phương pháp pha loãng bậc 10 thành các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4... - Dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng, hút cho vào các ống nghiệm (loạt 9 ống hoặc 15 ống được phân thành ba nhóm cho ba nồng độ) có chứa môi trường thích hợp (ví dụ: BGBL dùng cho coliforms) cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác (thường là 1ml) dung dịch mẫu ở ba nồng độ pha loãng liên tiếp. - Các ống nghiệm môi trường được ủ ở nhiệt độ và thời gian thích thích hợp (37oC trong 24-36 giờ). O - Xác định số ống dương tính (có biểu hiện sinh hơi, đổi màu, đục…) ở các loạt ống thí nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng tương ứng. R 3. Tính toán kết quả - Từ trị số của số ống có biểu hiện dương tính tương ứng ở ba nồng độ pha loãng liên IG tiếp, tiến hành tra bảng MPN (Bảng tra Mac Crady) cho loạt 9 ống hoặc 15 ống, xác định trị số MPN/100 ml của mẫu ban đầu. IN - Dựa vào độ pha loãng của các nồng độ chọn phân tích và thể tích mẫu pha loãng cấy vào mỗi ống nghiệm môi trường BGBL, tính toán mật độ của coliforms có mặt trong 100 ml hoặc 100 g mẫu ban đầu. Đối chiếu với TCVN, xác định chất lượng của mẫu thực A phẩm hoặc mẫu nước. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý L - Các ống nghiệm chứa môi trường BGBL có ống Durham phải hấp tiệt trùng cẩn thận đế tránh làm lẫn bọt khí vào ống Durham. - Trong trường hợp tất cả các ống nghiệm môi trường thử nghiệm đều dương tính hoặc đều âm tính thì phải tăng hoặc giảm số lần pha loãng để trong loạt thí nghiệm phải có ống âm tính và ống dương tính. V. BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày đặc điểm của nhóm vi khuẩn coliform. Tác hại của chúng đối với con người và đối với thực phẩm. - Trình bày nguyên tắc và phương pháp định lượng coliforms trong thực phẩm theo phương pháp MPN.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 119 SƠ ĐỒ KIỂM NGHIỆM COLIFORM – E.COLI Mẫu Đồng nhất mẫu Cân 10 g mẫu trong 90 ml nước peptone Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2 , 10-3, 10-4... O Tăng sinh R Chọn ba nồng độ liên tiếp thích hợp cấy 1 ml mẫu vào 10 ml canh BGBL, mỗi nồng độ cấy ba ống, ủ 37o/48h IG IN Ghi nhận số ống dương ở mỗi Chọn ống (+) cấy vào ống canh EC độ pha loãng ủ 44o ± 0.25 /24h A L Tra bảng MPN Chọn ống (+) cấy sang môi trường nước tryptone tính mật độ coliform ủ 44o/24h Thử phản ứng Indole bằng thuốc thử Kowac’s Tra bảng MPN, tính mật độ E.coli
120 Thực tập Vi sinh vật học Tiêu chuẩn sử dụng - ISO 4831:1991 Microbiology – General guidance for the enumeration of coliforms – Most probable number technique - ISO 7251: 2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection and anumerration of presumptive Escherichia coli – Most probable number technique. - Water quality – Detection and enmeration of coliforms arganisms, thermotolerant coliforms organisms and presumptive Escherichia coli – Part 2: multiple tube (most probable number) method. - Water quality – Detection and enmeration of Escherichia coli and coliform bacteria in surface and waste water – Part 3: Miniaturized method (most probable number) by inoculation in liquid medium. O R IG IN A L
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 121 Bài 16 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM I. NGUYÊN TẮC Petrifilm là màng quét lên một lớp chất dinh dưỡng và tác nhân tạo gel. Khi tiến hành xét nghiệm, 1 ml mẫu được cấy vào petrifilm và ủ. Chất màu đặc biệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường. Các đường kẻ ô giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn. Các phương pháp petrifilm đã được thử nghiệm và được AOAC công nhận. Đĩa petrifilm E. coli/Coliform Count (EC) có chứa violet red bile (VRB) - chất gel tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị hoạt động của glucuronidase và một chất chỉ thị giúp cho việc đếm khuẩn lạc dễ dàng hơn. Hầu hết E. coli (khoảng 97%) sinh beta- O glucuronidase, chất này tạo tủa màu xanh gắn kết với khuẩn lạc. Tấm film phía trên giữ bọt khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E. coli và coliforms. Khoảng 95% E. coli có sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo bọt khí trên đĩa R petrifilm. AOAC International và U.S FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) xác định IG coliform là trực khuẩn gram âm, hình que, sinh hơi và acid suốt quá trình lên men chuyển hoá lactose. Khuẩn lạc coliform phát triển trên đĩa petrifilm EC sinh acid, chất chỉ thị pH IN trong đĩa làm cho lớp keo có màu đỏ. Khí sinh ra được giữ lại xung quanh khuẩn lạc coliform màu đỏ là dấu hiệu để xác định coliform. Trong bài thực hành này chúng ta sẽ tiến hành định lượng coliforms trong nước giải A khát ngoài đường phố (giới hạn cho nước giải khát không cồn không đóng chai đối với coliforms chai 10 CFU/1g, theo QĐ 867/1988 của Bộ Y tế) bằng petrifilm và phương pháp L đổ đĩa truyền thống để so sánh. II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT 1. Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng nhóm (3 sinh viên) 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm ‫׎‬18 Cái 15 3 Bình tam giác 250 ml Cái 1 4 Cốc 100 ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1
122 Thực tập Vi sinh vật học Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng nhóm (3 sinh viên) 6 Pipette 1 ml Cái 5 7 Pipette 10 ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000 μl Cái 1 9 Đầu tuýp 1000 μl Cái 1 Dụng cụ dùng chung 10 Nồi hấp cao áp Cái 1 11 Tủ cấy vô trùng Cái 1 12 Tủ sấy Cái 1 13 Máy dập mẫu Cái 1 14 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 15 Tủ ấm Cái 1 O 2. Môi trường và hóa chất R - Tấm petrifilm dùng phân tích coliform và Escherichia coli - Nước muối sinh lý 0,9% IG - Nước cất vô trùng - Cồn 96o IN 3. Nguyên liệu khác - Thịt tươi A - Túi nilon dập mẫu L - Dịch vi khuẩn E. coli kiểm chứng. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Chuẩn bị mẫu phân tích - Dùng pipette vô trùng hút chính xác 10 ml dung dịch mẫu nước cần phân tích cho vào một túi dập mẫu hoặc một bình tam giác vô trùng. Đối với mẫu rắn cân chính xác 10 g mẫu bằng cân phân tích trong điều kiện vô trùng. - Bổ sung thêm 90 ml dung dịch nước muối peptone 1% hoặc nước muối sinh lý vô trùng. - Lắc đều bình tam giác hoặc đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 60 giây, 6-7 nhịp/giây, ta được độ pha loãng 10-1.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 123 Hình 16.1. Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích - Tiến hành pha loãng mẫu: Dùng pipette vô trùng hút chính xác 1ml dung dịch mẫu ở độ pha loãng 10-1, tiến hành pha loãng tiếp thành các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4... trên các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn chứa 9 ml dung dịch nước muối peptone 1% vô trùng hoặc nước muối sinh lý vô trùng. 2. Cấy mẫu - Tiến hành cấy mẫu quy trình đếm Coliforms bằng phương pháp đổ đĩa và ủ ở 37oC/2 ngày để làm mẫu đối chứng. O - Cấy dịch kiểm chứng trên một đĩa Petrifilm theo quy trình như sau: + Đặt tấm petrifilm lên mặt bàn phẳng vô trùng R + Dùng tay hoặc dùng kẹp inox lật màng film nilon phủ bề mặt đĩa petrifilm. IG + Dùng pipette vô trùng hoặc micropipette với đầu tuýp vô trùng hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng đã lựa chọn nhỏ lên giữa màng môi trường trên đĩa petrifilm. IN + Lật cuộn màng nilon trở lại cẩn thận để tránh tạo bọt khí, không được để tấm màng film nilon rơi xuống A + Dùng tấm nhựa chặn có mặt phẳng ở bên dưới dàn mỏng giọt dung dịch đều khắp màng môi trường trong vùng cấy. Dùng một lực nhẹ ấn lên tấm nhựa chặn trải đều mẫu lên L vùng cấy trước khi lớp gel hình thành. Tránh xoay hay trượt tấm nhựa chặn mẫu. + Lấy tấm nhựa chặn ra để lớp keo đông lại. - Tấm petrifilm được nuôi ủ ở nhiệt độ 35-37oC trong thời gian 18-24 giờ. Các tấm petrifilm có thể chồng lên đến 20 đĩa. - Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của coliforms và tính kết quả theo phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp bằng mắt hay bằng máy đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc E. coli có màu xanh và sinh khí; khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ và sinh khí.
124 Thực tập Vi sinh vật học O R IG IN A E. coli Coliform L Hình 16.2. Quy trình cấy mẫu vào đĩa petrifilm và cách nhận diện khuẩn lạc coliforms (màu hồng), E. coli (màu tím xanh) trên đĩa petrifilm Không phải coliform
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 125 4. Những điểm cần lưu ý - Không sử dụng đĩa này riêng rẽ để phát hiện E. coli O157. Như hầu hết những môi trường kiểm tra E. coli/coliform khác, đĩa này sẽ không hiển thị đặc biệt với bất kì dòng O157 nào có mặt. - Thao tác cấy mẫu vào đĩa petrifilm phải cẩn thận tránh làm lẫn bọt khí vào lớp gel. - Các tấm petrifilm có thể dùng để phân lập định danh vi sinh vật. - Sau khi đếm kết quả, các tấm petrifilm phải được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút trước khi loại bỏ. V. BÁO CÁO THỰC HÀNH - Trình bày nguyên tắc định lượng coliforms bằng phương pháp dùng petrifilm. - Trình bày phương pháp định lượng coliforms bằng phương pháp dùng petrifilm. - Giải thích sự hình thành màu và bọt khí của khuẩn lạc coliforms trên đĩa petrifilm. - Tính mật độ coliforms có trong mẫu ban đầu, đơn vị CFU/ml. O R IG IN A L
126 Thực tập Vi sinh vật học Bài 17 ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM – LÀM TƯƠNG ĐẬU I. NGUYÊN TẮC Tương là loại nước chấm giàu đạm được chế biến với nguyên liệu gạo nếp hoặc ngô đồ lên và ủ mốc để làm men chuyển hóa protein từ hạt đậu nành. Tương được sử dụng hàng ngày rất lợi cho sức khỏe, đặc biệt phù hợp trong các món ăn chay. Trong quá trình làm tương, protein khó tiêu trong hạt đậu tương được hỗn hợp enzyme protease và peptidase tiết ra bởi các chủng mốc tương (thường nhất là Aspergillus oryzae) phân giải thành các peptid và acid amin dễ tiêu. Dịch acid amin có thể được chiết một phần để làm nước tương. Phần bã đậu qua quá trình ngâm ủ có thể được sử dụng để làm tương hột. O II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT 1. Dụng cụ R Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng IG nhóm (3 sinh viên) 1 Đĩa petri Cái 2 2 Que cấy Cái 1 IN 3 Đèn cồn Cái 1 4 Rổ nhựa Cái 1 A 5 Nồi inox Cái 1 L 6 Chảo inox Cái 1 7 Bếp điện Cái 1 8 Lọ thủy tinh có nắp đậy Cái 1 Dụng cụ dùng chung 9 Nồi hấp cao áp Cái 1 10 Tủ cấy vô trùng Cái 1 11 Tủ ấm Cái 1 2. Hóa chất - Cồn 96o - Dịch xà phòng loãng