Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hoá học: Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol" nhằm chế tạo được dạng hạt nano và hệ hạt nano như: nano lycopen, nano resveratrol và hệ nano lycopen/resveratrol, hệ nano lycopen/pycnogenol. Xác định được hình thái và cấu trúc của các vật liệu nano thu được; Đánh giá được độ bền của các vật liệu nano trong các điều kiện bảo quản và môi trường khác nhau.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hoá học: Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  HỒ THỊ OANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, XÁC ĐỊNH HÌNH THÁI, CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT CÁC HỆ NANO CHỨA MỘT SỐ HỢP CHẤT LYCOPEN, RESVERATROL VÀ PYCNOGENOL Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số : 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2021
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Mai Hà TS. Đặng Thị Tuyết Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi.....giờ.....ngày....tháng......năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ngày nay, theo xu hướng sử dụng các nguồn nguyên liệu tự nhiên, các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lycopen, resveratrol, pycnogenol,... được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, chiết tách và ứng dụng một cách rộng rãi. Lycopen là một hợp chất thuộc nhóm carotenoid có hoạt tính chống oxy hóa cực mạnh, có tác dụng mạnh mẽ trong việc phòng chống ung thư, các bệnh tim mạch, xơ hóa gan và đóng vai trò quan trọng đối với hệ miễn dịch. Resveratrol là một stilbenoit kháng độc tố tự nhiên, tiềm năng ứng dụng của hợp chất là khả năng chống viêm, chống oxy hóa, chữa lành vết thương, chống vi khuẩn và chống ung thư. Pycnogenol được biết đến là một hỗn hợp flavonoid quý cũng có khả năng chống oxy hóa và chống viêm nổi tiếng. Hợp chất giúp tăng cường sức khỏe tim mạch, bảo vệ tế bào thần kinh, kiểm soát các cơn đau và chống lại các gốc tự do. Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học quý nhưng hầu hết các hợp chất nêu trên được xếp vào nhóm hợp chất có độ tan trong nước rất thấp và khó hấp thu hiệu quả vào cơ thể, do vậy sinh khả dụng bị hạn chế. Để khắc phục những nhược điểm về độ hòa tan và độ bền, việc nghiên cứu chế tạo các hợp chất sinh học tự nhiên dưới dạng hạt nano hứa hẹn sẽ tạo ra những nguồn dược liệu quý ứng dụng cho các ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Mặt khác, sự kết hợp giữa các hợp chất cho sản phẩm tổ hợp có tác dụng hiệp đồng, mang lại hoạt tính sinh học cao hơn so với việc sử dụng từng hợp chất riêng rẽ. Hai hợp chất resveratrol và pycnogenol được biết đến là các hợp chất sinh học có tác dụng tăng độ bền và tăng khả năng phân tán trong nước cho các hợp chất thuộc nhóm carotenoit có nhiều liên kết đôi liên hợp như lycopen. Tuy nhiên cho tới nay, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chế tạo hỗn hợp compozid của các hợp chất mà chưa có công trình công bố chế tạo hệ nano, đặc biệt là hệ nano lycopen/resveratrol và hệ nano lycopen/pycnogenol. Chính bởi vậy, nghiên cứu chế tạo hai hệ nano 1
này là một hướng nghiên cứu mới và cần thiết. Do đó, việc thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol” có tính thời sự, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Chiết tách được lycopen từ quả gấc, resveratrol từ cốt khí củ và tổng hợp được copolyme PLA-PEG làm nguyên liệu cho quá trình chế tạo các dạng hạt nano; - Chế tạo được dạng hạt nano và hệ hạt nano như: nano lycopen, nano resveratrol và hệ nano lycopen/resveratrol, hệ nano lycopen/pycnogenol. Xác định được hình thái và cấu trúc của các vật liệu nano thu được; - Đánh giá được độ bền của các vật liệu nano trong các điều kiện bảo quản và môi trường khác nhau. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Nghiên cứu chiết tách lycopen từ quả gấc và resveratrol từ cốt khí củ. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp và phương pháp chiết tách các hợp chất. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của lycopen và resveratrol sau quá trình chiết tách; - Nghiên cứu tổng hợp copolyme PLA-PEG sử dụng làm chất bao bọc vi nang cho các hệ nano tổ hợp chứa lycopen; - Nghiên cứu chế tạo nano lycopen, nano resveratrol có khả năng phân tán tốt trong nước. Xác định hình thái, cấu trúc, tính chất của các mẫu nano bằng các phương pháp phân tích hiện đại. Khảo sát độ bền của bột nano trong các điều kiện bảo quản và môi trường khác nhau; - Nghiên cứu chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol và hệ nano lycopen/pycnogenol. Xác định hình thái, cấu trúc và tính chất của các mẫu nano bằng các phương pháp phân tích hiện đại. Nghiên cứu độ bền của lycopen trong các hệ nano theo thời gian bảo quản ở các điều kiện khác nhau. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Tổng quan gồm 3 phần chính: Phần 1 tổng quan về các đối tượng nghiên cứu là các hợp chất sinh học tự nhiên như lycopen từ trái gấc, resveratrol từ cốt khí củ và pycnogenol từ cây thông đỏ. Quá trình thu thập, tìm hiểu và nghiên cứu về các hợp chất trên cho thấy sinh khả dụng của chúng bị hạn chế do tính chất kém tan và kém bền. Công nghệ nano được đánh giá là một giải pháp hữu hiệu trong việc nâng cao khả năng phân tán, cải thiện sự hấp thu, tăng cường dược tính và nâng cao độ bền cho các hợp chất sinh học tự nhiên. Do đó, phần 2 tổng quan về phương pháp nghiên cứu chế tạo dạng nano của các hợp chất tự nhiên. Phần 3 trình bày tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về dạng hạt nano của các hợp chất có hoạt tính sinh học, cụ thể là nano lycopen, nano resveratrol và hệ nano lycopen/resveratrol, hệ nano lycopen/pycnogenol. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Chiết tách các hợp chất tự nhiên lycopen và resveratrol sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình chế tạo các dạng hạt nano của chúng 2.2.2. Tổng hợp copolyme PLA-PEG 2.2.3. Nghiên cứu chế tạo các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol 2.2.3.1. Chế tạo nano lycopen và nano resveratrol Lycopen hoặc resveratrol với các hàm lượng khác nhau cùng chất hoạt động bề mặt là tween 80 và cremophor RH40 được hòa tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ bằng máy khuấy từ trong 30 phút. Dung dịch sau đó được nhỏ từ từ từng giọt vào 100 ml nước cất có chứa PEG 6000, đồng thời khuấy đều ở tốc độ 9000 vòng/phút trong vòng 15 phút để thu được dung 3
dịch hỗn hợp đồng nhất. Tiếp tục tạo bột nano bằng phương pháp sấy phun. Lắp đặt máy và cài đặt chương trình chạy cho máy, sau khi sấy phun thu mẫu và vệ sinh máy. Các sản phẩm nano thu được đều ở dạng bột mịn và tơi. Nano lycopen thu được có màu đỏ tươi còn nano resveratrol thu được có màu trắng ngà. 2.2.3.2. Chế tạo hệ nano tổ hợp chứa lycopen  Chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol Lycopen và resveratrol được phối trộn với các tỷ lệ khác nhau lần lượt là 1:2, 1:1 và 2:1, sau đó thêm các chất hoạt động bề mặt và chất bao bọc vi nang copolyme tổng hợp ở trên, hòa tan các thành phần trong dung môi tetrahyđrofuran sử dụng máy đồng nhất Ultra-Turrax với tốc độ 8400 vòng/phút trong 45 phút; hỗn hợp sau khi đã hòa tan hoàn toàn được bổ sung từ từ vào dung dịch nước cất đồng thời khuấy đều ở tốc độ 9000- 10000 vòng/phút trong khoảng thời gian 30 phút. Dung dịch hệ nano lycopen/resveratrol trong nước sau đó được đưa vào hệ thống máy sấy phun, thu được bột nano lycopen/resveratrol có màu đỏ mận.  Chế tạo hệ nano lycopen/pycnogenol Lycopen và pycnogenol được phối trộn với các tỷ lệ khác nhau, sau đó thêm chất hoạt động bề mặt Tween 80, các thành phần hòa tan hoàn toàn trong dung môi tetrahydrofuran (THF) bằng máy khuấy từ, trong thời gian là 60 phút. Dung dịch thu được được nhỏ từ từ vào dung dịch nước cất có chứa copolyme PLA-PEG trong điều kiện khuấy 9000 vòng/phút, thời gian 30 phút. Tiếp theo, hỗn hợp đồng nhất đưa vào hệ thống cất quay chân không để loại dung môi THF. Hệ nano lycopen/pycnogenol trong nước sau đó được làm lạnh ở -54oC. Sau thời gian 24 giờ đóng đá, mẫu lycopen/pycnogenol được chuyển vào hệ thống thiết bị đông khô. Cuối cùng, thu được bột nano lycopen/pycnogenol mịn, tơi và có màu đỏ tươi. 2.2.4. Nghiên cứu các phương pháp tạo bột nano - Phương pháp sấy phun. - Phương pháp đông khô. 4
2.2.5. Các phương pháp phân tích định lượng Định lượng lycopen và resveratrol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và quang phổ hấp thụ UV-Vis. 2.2.6. Đánh giá độ bền của các hạt nano - Khảo sát sự biến đổi hàm lượng hợp chất của các hạt nano. - Nghiên cứu sự biến đổi hình thái của các hạt nano. 2.2.7. Các phương pháp phân tích cấu trúc và tính chất của vật liệu - Xác định cấu trúc của các vật liệu bằng phổ hồng ngoại (FT-IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). - Xác định khối lượng phân tử của copolyme PLA-PEG bằng GPC. - Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt của các sản phẩm bột nano bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS. - Đánh giá hình thái và kích thước các mẫu vật liệu nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chiết tách lycopen, resveratrol và tổng hợp copolyme PLA- PEG, sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho quá trình chế tạo các hệ nano 3.1.1. Chiết tách hợp chất lycopen từ màng quả gấc 3.1.1.1. Xác định nhiệt độ, thời gian thích hợp cho quá trình sấy màng gấc Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ và thời gian thích hợp cho việc sấy màng hạt gấc là 60oC trong vòng 15 giờ. 3.1.1.2. Xác định dung môi hữu cơ phù hợp để chiết lycopen từ màng gấc khô bằng phương pháp soxhlet Hợp chất tan tốt nhất trong dung môi cloroform, sau đó giảm dần từ tetrahydrofuran, diclometan đến hexan. Tuy nhiên, do độc tính thấp nhất, diclometan được lựa chọn là dung môi thích hợp để chiết lycopen. 3.1.1.3. Đánh giá cấu trúc và độ tinh khiết của lycopen chiết tách được a) Phân tích cấu trúc lycopen chiết tách được bằng phổ FT-IR Trên phổ FT-IR xuất hiện các băng sóng hấp thụ đặc trưng cho các 5
nhóm chức có mặt trong phân tử. Băng sóng xuất hiện ở 3038 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết =CH (alkene), ở 2912 cm−1 và 2854 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết =CH (alkane). Dao động hóa trị đặc trưng của liên kết C=C (alkene) xuất hiện ở 1626 cm−1. Các băng sóng xuất hiện ở 1439 cm−1 và 1390 cm−1 lần lượt là băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động biến dạng của nhóm –CH2 và -CH3. Đặc biệt, băng sóng hấp thụ mạnh ở 959 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng ngoài mặt phẳng của =CH (trans-alkene). b) Phân tích cấu trúc lycopen chiết tách được bằng phổ NMR Hình 3.6. Công thức cấu tạo của lycopen Trên phổ H-NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho các 1 proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu cộng hưởng xuất hiện ở trường yếu nhất δ=6,66-6,60 ppm (m, 2H) được quy kết cho proton H-7&H-11. Các proton khác của alkene được quy kết cụ thể như sau: δ=6,49 ppm (dd, J=11,0; 15,0 Hz; 1H; H-12); 6,35 ppm (d; J=15,0 Hz, 1H; H-8); 6,26-6,19 ppm (m; 2H; H-15&H-14); 6,18 ppm (d; J=11,5 Hz; 1H; H-10); 5,95 ppm (d; J=11,0 Hz; 1H; H-6); 5,12-5,09 ppm (m; 1H; H-2). Các proton khác của phần alkane được quy kết cụ thể như sau: 2,12 ppm (d; J=4,5 Hz; 4H; H- 4&H-3); 1,97 ppm (s; 6H; 2CH3); 1,82 ppm (s; 3H; CH3), 1,69 ppm (s; 3H; CH3), 1,61 ppm (s; 3H; CH3). Phổ 13C-NMR chỉ ra các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các nguyên tử carbon tương đươn g có mặt trong phân tử. Tín hiệu cộng hưởng xuất hiện ở trường yếu δ=139,5 ppm được gán cho C-5. Các tín hiệu cộng hưởng của các nguyên tử carbon alkene được quy kết như sau: δppm: 137,4 (C- 13); 136,5 (C-9); 136,2 (C-1); 135,4 (C-12); 132,7 (C-15); 131,6 (C-8); 6
130,1 (C-14); 125,8 (C-7); 125,2 (C-6); 124,0 (C-2); 40,2 (C-4); 26,7 (C-3); 25,6 (CH3); 17,7 (CH3); 17,0 (CH3); 12,9 (CH3); 12,8 (CH3). So sánh dữ liệu thu được với phổ chuẩn của lycopen cho thấy, các tín hiệu xuất hiện hoàn toàn phù hợp, chứng tỏ sản phẩm sau tách chiết là lycopen. c) Định lượng lycopen bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis Phổ UV-Vis cho thấy, ở cùng một nồng độ, băng sóng hấp thụ ở 517 nm của mẫu lycopen chiết tách được cao hơn mẫu lycopen chuẩn có độ tinh khiết 98% của Sigma-Aldrich khoảng 1%. Như vậy, có thể kết luận là độ tinh khiết của mẫu lycopen chiết tách được đạt độ tinh khiết trên 98%. d) Định lượng lycopen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 750 500 250 0 10 20 30 40 50 60 Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu lycopen chiết tách được khai triển bằng hệ dung môi MeOH:ACN:DCM (10:50:40) Kết quả định lượng bằng HPLC (Hình 3.10) cho thấy lycopen chiết tách được đạt độ tinh khiết > 98%, kết quả này phù hợp với kết quả định lượng bằng phổ UV-Vis. 3.1.1.4. Bảo quản lycopen Lycopen bị phân hủy nhanh chóng khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. Ở nhiệt độ 4oC, tương ứng với nhiệt độ ngăn mát của tủ lạnh, lycopen bị phân hủy chậm hơn. Ở nhiệt độ -16oC, lycopen tương đối bền, hàm lượng lycopen còn lại 92% sau 3 tháng bảo quản. Do vậy, điều kiện bảo quản lycopen là bao gói lycopen trong giấy bạc, hút chân không, sau đó lưu trữ ở -16oC. 7
3.1.2. Nghiên cứu chiết tách hợp chất resveratrol từ rễ cốt khí củ 3.1.2.1. Phân tích cấu trúc của resveratrol sau quá trình chiết tách a) Phân tích cấu trúc resveratrol chiết tách được bằng phổ FT-IR Phổ FT-IR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của resveratrol. Băng sóng hấp thụ rõ nét nhất xuất hiện ở 3230 cm−1, đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết O−H (phenol). Băng sóng hấp thụ ở 3021 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm vinyl (=C−H), ở 2890 cm−1 thể hiện dao động hóa trị của liên kết =C−H (alkane). Các dao động hóa trị ν(C=C) của vòng benzen thể hiện ở các băng sóng hấp thụ 1609 cm−1, 1579 cm−1, 1510 cm−1 và 1447 cm−1. Dao động biến dạng trong mặt phẳng của nhóm OH xuất hiện ở băng sóng hấp thụ 1382 cm−1. Dao động hóa trị của liên kết C-O (từ nhóm phenol) thể hiện rõ trong phổ ở 1150 cm−1. Ngoài ra, băng sóng hấp thụ ở 968 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết C-H thay thế trên C=C từ định hướng trans. Đối với băng sóng ở 833 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết C-H của vòng benzene và ở 673 cm−1 là băng sóng thể hiện dao động biến dạng ngoài mặt phẳng γ(OH) của nhóm -OH. b) Phân tích cấu trúc resveratrol chiết tách được bằng phổ NMR Hình 3.15. Công thức cấu tạo của resveratrol Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) cho thấy các tín hiệu đặc trưng cho proton của resveratrol. Các tín hiệu cộng hưởng trong vùng δH 6,11-7,38 ppm đặc trưng cấu trúc dạng phenolic của resveratrol. Các tín hiệu proton xuất hiện tại H 6,38 (d, J = 2,0; 2H) và 6,11 (t, J = 2,0; 1H) cho thấy sự có mặt của 1 vòng thơm có cấu trúc đối xứng bị thế ở 3 vị trí 1, 3 và 5. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của cặp tín hiệu thuộc hệ tương tác spin hệ AA'- BB' tại H 6,75 (d, J = 8
9,0; 2H) và 7,38 (d, J = 8,5; 2H) thể hiện sự có mặt của một nhân benzen thế para. Phổ 13C-NMR chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của các nguyên tử C. Quy ghép các tín hiệu cộng hưởng và các nguyên tử carbon trong resveratrol cho kết quả các tín hiệu của 14 nguyên tử cacbon trong đó có 9 cacbon metin và 5 cacbon bậc bốn. Các giá trị cacbon metin cộng hưởng tại vị trí C 104,3 (C2, C-6); 101,7 (C-4); 127,8 (C-2′, C-6′); 115,5 (C-3′, C-5′); 127,8 (C-7) và 125,6 (C8). 5 cacbon bậc 4 xuất hiện tại C 139,2 (C-1); 158,4 (C-3, C- 5); 28,1 (C-1′) và 157,1 (C-4′). Ngoài ra, hằng số tương tác JH-7=16,5 Hz chứng tỏ rằng liên kết đôi C7/C8 có cấu hình trans. So sánh dữ liệu thu được với phổ chuẩn của resveratrol cho thấy các tín hiệu xuất hiện hoàn toàn phù hợp, chứng tỏ sản phẩm sau tách chiết chính là trans-resveratrol. 3.1.2.2. Định lượng resveratrol bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC a) Định lượng resveratrol bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis Phổ UV-Vis cho thấy, ở cùng một nồng độ, băng sóng hấp thụ ở 310 nm của mẫu resveratrol chiết tách được thấp hơn mẫu resveratrol chuẩn có độ tinh khiết 95% của Sigma-Aldrich khoảng 2,7%. Như vậy, độ tinh khiết của resveratrol sau quá trình chiết tách và tinh chế đạt trên 92%. b) Định lượng resveratrol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC DAD1 B, Sig=310,4 Ref=360,100 (RESVERATROL\21061107.D) mAU mAU 9.331 700 700 310nm 500 600 500 500 400 400 300 300 200 200 100 100 00 00 5 5 10 10 15 15 20 20 min 25 30 Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu resveratrol chiết tách được khai triển bằng hệ dung môi MeOH – H2O + 0,1%Fa = 40 – 60 (v/v) 9
Kết quả định lượng bằng HPLC (Hình 3.19) cho thấy resveratrol chiết tách được đạt độ tinh khiết là 92,3%, kết quả này phù hợp với kết quả định lượng resveratrol bằng phổ UV-Vis. 3.1.3. Kết quả tổng hợp copolyme PLA-PEG Bảng 3.9. Khối lượng phân tử của các mẫu copolyme khối PLA-PEG Mẫu Mw (Da) PDI PLA-PEG.1 8400 1,2 PLA-PEG.2 11600 1,4 PLA-PEG.3 17200 1,7 Bảng 3.9 cho thấy khối lượng phân tử copolymer thu được tăng dần khi tăng tỷ lệ lactide/mPEG. Polylactide là một polyme kị nước do đó mẫu PLA-PEG.1 với tỷ lệ mol nPEG:nlactide = 1:20 có khối lượng phân tử là 8400 cho độ hòa tan trong nước tốt phù hợp để chế tạo các hạt nano. Mẫu PLA- PEG.1 sau đó được sử dụng để nghiên cứu chế tạo các hệ nano tổ hợp chứa lycopen. Phổ hồng ngoại cho thấy các băng sóng hấp thụ đặc trưng riêng của PLA, và PEG đều được thể hiện trên phổ của copolyme PLA-PEG. Băng sóng hấp thụ ở 3444 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm -OH trong phân tử PEG. Băng sóng rộng ở 2877 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị của C-H2, 1759 cm−1 tương ứng đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=O trong phân tử PLA. Hai băng sóng 1454 cm−1 và 1382 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng nhóm C-H, băng sóng 1249 cm−1 đặc trưng cho dao động nhóm C-O-H, băng sóng 1097 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng nhóm –OH. Cấu trúc của copolyme PLA-PEG được khẳng định bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR đo trong CDCl3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton cho thấy các tín hiệu đặc trưng cho proton của copolyme PLA-PEG. Tín hiệu cộng hưởng và vị trí proton trong copolyme PLA-PEG như sau: - Tín hiệu tại δ=1,59 ppm là của proton nhóm CH3 trong PLA 10
- Tín hiệu tại δ=5,03 ppm là của proton nhóm CH trong PLA - Tín hiệu tại δ=3,63 ppm là của proton nhóm CH2 trong PEG Phổ C-NMR chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của các nguyên tử C. Quy kết 13 các tín hiệu cộng hưởng cho các nguyên tử cacbon trong copolyme PLA- PEG cho kết quả như sau: - Tín hiệu tại δ=169,5 là của cacbon nhóm C=O trong PLA - Tín hiệu tại δ=77,2 là của cacbon nhóm O-CH2 trong PEG - Tín hiệu tại δ=70,5 là của cacbon nhóm O-CH trong PLA - Tín hiệu tại δ=16,7 là của cacbon nhóm methyl CH3 trong PLA. 3.2. Kết quả chế tạo các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol 3.2.1. Kết quả chế tạo nano lycopen 3.2.1.1. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới quá trình chế tạo nano lycopen 12 10 Sự phân bố (%) 8 NLy21 6 NLy12 4 NLy1 2 0 0 50 100 150 200 250 Đường kính hạt (nm) Hình 3.23. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano lycopen theo các tỷ lệ khác nhau giữa lycopen và chất hoạt động bề mặt tween 80 Các mẫu NLy1, NLy12, NLy21 tương ứng với tỷ lệ hàm lượng lycopen/tween 80 là 1/1, 1/2 và 2/1 cho kết quả đường kính hạt trung bình lần lượt là 55 nm, 65 nm và 76 nm (Hình 3.23). Giản đồ phân bố kích thước 11
hạt cho thấy mẫu NLy1 có sự phân bố hẹp và kích thước hạt trung bình dưới 100 nm. Do đó, tỷ lệ lycopen/tween 80 là 1/1 được lựa chọn cho công thức nano lycopen. Để đánh giá hiệu quả của các chất hoạt động bề mặt tới quá trình chế tạo hạt nano lycopen, chất hoạt động bề mặt Tween 80 trong công thức chế tạo nano ở trên được thay thế bằng cremophor RH40. Kết quả đo DLS của các mẫu nano lycopen cho thấy các tiểu phân trong mẫu NLy1 (sử dụng chất hoạt động bề mặt là tween 80) và các tiểu phân trong mẫu NLy11 (sử dụng chất hoạt động bề mặt là cremophor RH40) có đường kính hạt trung bình lần lượt là 55 nm và 51 nm (Hình 3.24). Không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 mẫu này. Tuy nhiên, Polysorbate 80 là một chất hoạt động bề mặt có tính phổ biến và giá thành rẻ hơn so với cremophor RH40. Do đó, Tween 80 được lựa chọn là chất hoạt động bề mặt cho quá trình chế tạo các hệ hạt nano. 12 10 Sự phân bố (%) 8 NLy1 6 NLy11 4 2 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Đường kính hạt (nm) Hình 3.24. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano lycopen sử dụng chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 và Tween 80 3.2.1.2. Đánh giá khả năng phân tán trong nước của các mẫu bột nano lycopen 12
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá khả năng phân tán trong nước của lycopen và các mẫu nano lycopen Khả năng phân tán Quan sát đáy lọ thủy tinh Mẫu trong nước sau 01 ngày Lycopen Rất kém Lắng NLy1 Rất tốt Rất trong (4% lycopen) NLy3 Rất tốt Rất trong (8% lycopen) NLy5 Tốt Có hiện tượng lắng (12% lycopen) 3.2.1.3. Phân tích cấu trúc của các mẫu bột nano lycopen Phổ FT-IR cho thấy các băng sóng đặc trưng của PEG: ở 3438 cm−1 (- OH), 2886 cm−1 (CHstr(sp2)), hay 1111 cm−1 đặc trưng của liên kết giữa các nhóm C–C–O và C–C–H, đều được thể hiện rõ trong phổ hồng ngoại của các mẫu bột NLy1, NLy3 và NLy5. Đối với các băng sóng đặc trưng của lycopen: băng sóng hấp thụ ở 2907 cm−1, 2850 cm−1 (CHstr(sp3)), 1670 cm−1, 1642 cm−1 (C=Cstr(trans)), 1443 cm−1 (CH2(dao động biến dạng)) và 963 cm−1 (CH(trans OOP)) có xuất hiện trong các mẫu nano lycopen nhưng không rõ nét. Điều này được lý giải do hàm lượng lycopen chứa trong mẫu bột nano ít hơn nhiều so với hàm lượng chất mang PEG trong nano lycopen. 3.2.1.4. Hình thái và sự phân bố kích thước hạt của nano lycopen Giản đồ phân bố kích thước hạt (Hình 3.28 a) cho thấy, các mẫu Nly1, NLy3 và NLy5 (với hàm lượng lycopen từ 4-12%) có đường kính hạt trung bình lần lượt là 55 nm, 135 nm và 289 nm, tương ứng với kết quả ảnh TEM (Hình 3.28 b, c và d). Sự thay đổi kích thước hạt của các mẫu tỷ lệ thuận với hàm lượng lycopen có trong các mẫu bột nano, có nghĩa là hàm lượng lycopen tăng dẫn tới kích thước hạt lớn dần. Ảnh TEM chỉ ra rằng các hạt nano lycopen có dạng hình cầu, phân bố đồng đều và không có hiện tượng kết đám với nhau. 13
Hình 3.28. Giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu bột nano lycopen (a) và ảnh TEM của các mẫu (b)-NLy1, (c)- NLy3, (d)- NLy5 3.2.1.5. Đánh giá độ bền của nano lycopen Ở điều kiện nhiệt độ phòng, lycopen có trong các mẫu bột nano bị phân hủy đáng kể (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Độ bền của lycopen trong các mẫu bột nano theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng Độ bền (Hàm lượng lycopen còn lại (%)) Mẫu 0 ngày 15 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày NLy1 100 90,2 80,4 70,2 60,1 NLy3 100 91,3 82,7 73,6 64,5 NLy5 100 92,4 84,9 76,9 69,0 Sau thời gian 90 ngày bảo quản, hàm lượng lycopen còn lại trong các mẫu NLy1, NLy3 và NLy5 lần lượt là 60,1%, 64,5% và 69%. Như vậy, sự phân hủy lycopen nhanh nhất xảy ra ở mẫu NLy1 tương ứng với hàm lượng lycopen có trong mẫu là 4%, sau đó đến mẫu NLy3 (hàm lượng lycopen là 14
8%) và cuối cùng sự phân hủy lycopen xảy ra chậm nhất ở mẫu NLy5 (hàm lượng lycopen là 12%). 3.2.2. Kết quả chế tạo nano resveratrol 3.2.2.1. Đánh giá khả năng phân tán trong nước của các mẫu bột nano resveratrol Bảng 3.12. Khả năng phân tán trong nước của resveratrol và các mẫu nano resveratrol Khả năng phân tán Quan sát đáy lọ thủy Mẫu trong nước tinh sau 01 ngày Resveratrol Rất kém Lắng NR1 Rất tốt Rất trong (10% resveratrol) NR2 Rất tốt Rất trong (15% resveratrol) NR3 Trong và không có hiện Rất Tốt (20% resveratrol) tượng bị lắng 3.2.2.2. Phân tích cấu trúc của các mẫu bột nano resveratrol Một số băng sóng đặc trưng của PEG xuất hiện rõ nét trên phổ FT-IR: ở 3438 cm−1 (-OH), 2886 cm−1 (CHstr(sp2)), hay 1111 cm−1 đặc trưng của liên kết giữa các nhóm C–C–O và C–C–H, đều được thể hiện rõ trong phổ hồng ngoại của các mẫu bột NR1, NR2 và NR3. Một số băng sóng đặc trưng của resveratrol như: băng sóng hấp thụ ở 3279 cm−1 (-OH), 964 cm−1 (trans- olefinic), 1584 cm−1 (C=C) và 1145 cm−1 (C-O) có xuất hiện trong các mẫu nano resveratrol nhưng không rõ nét. Điều này được lý giải do hàm lượng resveratrol chứa trong mẫu bột nano ít hơn nhiều so với hàm lượng chất mang PEG trong nano resveratrol. 3.2.2.3. Hình thái hạt nano resveratrol Giản đồ phân bố kích thước hạt trong Hình 3.32a cho thấy các hạt nano resveratrol NR1, NR2 và NR3 có đường kính hạt trung bình lần lượt là 12 nm, 19 nm và 38 nm, tương ứng với ảnh TEM (Hình 3.32 b, c và d). Nhận thấy, hàm lượng resveratrol tăng dẫn tới kích thước hạt nano tăng dần. Ảnh 15
TEM (Hình 3.32b) cho thấy, sản phẩm nano chứa hàm lượng resveratrol 10% (NR1) có dạng hình cầu, kích thước hạt nhỏ trong dải từ 10-18 nm. Tương tự ở hình 3.32c và d, kích thước hạt nano trong dải từ 14-21 nm (mẫu NR2), 35-42 nm với mẫu NR3. Hình thái hạt và sự phân bố kích thước hạt của các mẫu bột nano hoàn toàn tương ứng với đánh giá cảm quan sự phân tán trong nước của các mẫu bột sản phẩm thu được. Hình 3.32. Giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu bột nano resveratrol (a) và ảnh TEM của các mẫu (b)-NR1, (c)- NR2, (d)- NR3 3.2.2.4. Khảo sát độ ổn định và hình thái hạt nano resveratrol trong các môi trường có độ pH khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy nano resveratrol tương đối ổn định trong điều kiện môi trường axit, tốc độ phân hủy của nano resveratrol tăng lên nhanh trong các môi trường kiềm. Cụ thể, tại pH 4,5 và 7, hàm lượng resveratrol còn lại lần lượt là 90% và 62,8% sau 1 ngày, tuy nhiên tại pH 8 hàm lượng resveratrol còn lại sau 1 ngày là 51,4% và ở pH 9 hàm lượng resveratrol còn lại sau 180 phút là 20,5%. Trong khi đó, theo nghiên cứu của Š. Zupančič, Z. Lavrič, và J. Kristl thì ở pH 9, trans-resveratrol đã bị 16
phân hủy hoàn toàn trong vòng 10,1 phút. Như vậy, việc bào chế resveratrol dưới dạng hạt nano đã nâng cao được độ ổn định của resveratrol. Điều này được giải thích là do vai trò của chất hoạt động bề mặt tween 80 và chất bao bọc PEG 6000 giúp bảo vệ resveratrol khỏi sự tác động của môi trường kiềm. 3.2.3. Kết quả chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol 3.2.3.1. Phân tích cấu trúc hệ nano lycopen/resveratrol Nhận thấy rằng, băng sóng hấp thụ đặc trưng của nhóm -OH trong phổ FT-IR của resveratrol là ở 3250 cm−1. Tuy nhiên, trong phổ FT-IR của hệ S1, S4 và S7 cho thấy nhóm -OH của resveratrol đã được kéo dài chuyển sang các vị trí dao động lần lượt là 3365 cm−1, 3398 cm−1, 3375 cm−1, điều này chỉ ra rằng có sự tương tác liên kết hydro liên phân tử xảy ra giữa resveratrol và chất hoạt động bề mặt/copolyme PLA-PEG. Bên cạnh đó, các băng sóng hấp thụ của lycopen trong các hệ nano S1, S4 và S7 ở phổ FT-IR cũng dịch chuyển dao động so với các băng sóng đặc trưng trong phổ FT-IR của lycopen. Ví dụ, dao động CHstr(sp2) của lycopen trong hệ nano có xu hướng dịch gần về các bước sóng 2923 cm−1, 2924 cm−1, 2922 cm−1 trong khi dao động này ở phổ FT-IR của lycopen tinh khiết là 3038 cm−1. Sự thay đổi vị trí các băng sóng hấp thụ này cho thấy sự tương hợp tốt giữa lycopen và copolyme PLA-PEG. Một ví dụ khác cũng cho thấy dao động C=Cstr(trans) của lycopen trong hệ nano S1, S4 và S7 lần lượt ở các bước sóng 1593 cm−1, 1604 cm−1, 1604 cm−1 trong khi dao động này của lycopen tinh khiết là 1625 cm−1. Hiện tượng này là do tương tác ngoại phân tử giữa lycopen và resveratrol. Cấu trúc của hệ nano cũng đã được phân tích bằng phổ UV-Vis. Các băng sóng hấp thụ đặc trưng của resveratrol trong các hệ nano lần lượt xuất hiện ở hai bước sóng 295 nm và 310 nm. Ba băng sóng pic hấp thụ đặc trưng của lycopen trong hệ nano lần lượt là 450 nm, 479 nm, 510 nm. Phổ UV-Vis cho thấy, cường độ hấp thụ của các pic resveratrol và lycopen trong 17
các mẫu tương ứng tỷ lệ với tỷ lệ hàm lượng hai hợp chất resveratrol và lycopen có trong hệ nano lycopen/resveratrol. 3.2.3.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố kích thước hạt của hệ nano lycopen/resveratrol Giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu S1, S4 và S7 trong nước ở Hình 3.39a chỉ ra rằng, đường kính hạt trung bình của các mẫu lần lượt là 66 nm, 79 nm và 102 nm. Ảnh TEM (Hình 3.39b, 3.39c và 3.39d) cho thấy, các hạt nano thu được có dạng hình cầu. Kích thước hạt tỷ lệ thuận với tỷ lệ lycopen/resveratrol. Sự tương hợp tốt giữa lycopen và resveratrol trong quá trình chế tạo đã cho hệ hạt nano phân bố tương đối đồng đều, kích thước hạt nhỏ dưới 100 nm mặc dù tổng hàm lượng hai hợp chất lycopen và resveratrol lên tới 12%. Hình 3.39. Giản đồ phân bố kích thước hạt (a) và ảnh TEM của các mẫu (b)- S1, (c)- S4, (d)- S7 Kết quả đánh giá hình thái và sự phân bố kích thước hạt cũng cho thấy sự kết hợp giữa các hợp chất tự nhiên cho sản phẩm tổ hợp có tác dụng hiệp đồng và tối ưu. Hệ nano lycopen/resveratrol chứa hàm lượng lycopen là 4% và resveratrol là 8%, tức tổng hàm lượng hai hợp chất lên tới 12% thì kích 18