Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài "Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA" với mục tiêu: Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21 HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội 2015
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. BS Trần Huy Thịnh 2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy Phản biện 1: PGS.TS. Trần Vân Khánh Phản biện 2: TS. Nguyễn Đình Thắng Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp cơ sở chấm luận văn Thạc sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội, vào hồi 09 giờ, ngày 26 tháng 1 năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham gia vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận; trong đó, thể thiếu 21 hydroxylase (21OH) hay gặp nhất và chiếm tỷ lệ 90 95%, tiếp theo là thể thiếu 11βhydroxylase chiếm 5 9%, còn lại là các thể bệnh rất hiếm gặp do thiếu hụt 3βhydroxy steroid dehydrogenase (3βHSD), 17αhydroxylase và 20, 22 desmolase [1]. Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21hydroxylase là bệnh di truyền đơn gen lặn, trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2 gây nên. Đối với thể nặng, nếu bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn suy thượng thận cấp và bệnh nhân có thể tử vong. Các thể bệnh khác có thể dẫn đến nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; do đó bệnh ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh sản, tâm lý của người bệnh và gia đình [6]. Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 30%, là dạng đột biến gây ra thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định bằng các kỹ thuật PCR thông thường. Gần đây, kỹ thuật MLPA là một phương pháp mới với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản và độ nhạy cao đã phát hiện chính xác các dạng đột biến này trên gen CYP21A2. Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA vẫn chưa được khai thác nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác định người lành mang gen gây các bệnh di truyền. Chính vì vậy nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát 1
hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 OH. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21HYDROXYLASE 1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh dục thượng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, do sự thiếu hụt các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận. Trong đó, sự thiếu hụt enzym 21 hydroxylase (21 OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 95%, tiếp đến là sự thiếu hụt enzym 11β hydroxylase (11 OH), 3β hydroxysteroid dehydrogenase (3β HSD), 17α hydroxylase (17 OH) và ít gặp hơn là sự thiếu hụt 20 22 desmolase [35]. Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21 hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ở các mức độ nặng hay nhẹ khác nhau. Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21 hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thượng thận cấp và cường androgen, thiếu enzym 21 hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 3%) sẽ biểu hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cường androgen và khi enzym 21 hydroxylase giảm nhẹ (20 50%) sẽ xuất hiện thể bệnh không cổ điển [15]. 1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới 2
Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phân biệt vỏ và tủy thượng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thượng thận và tuyến sinh dục [8]. Bệnh nhân TSTTBS thể mất muối đầu tiên được Butler (1939) và Wilkins (1940) mô tả. Năm 1950 1951, Wilkins, Bartter và cộng sự đã chứng minh rằng việc sử dụng cortisol có thể ức chế sự tổng hợp thừa androgen trong hội chứng sinh dục thượng thận do TSTTBS [9]. Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ những năm 1930 và được mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thường. Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và sự liên kết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC). Sau đó, Komainami phân lập được Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn. Năm 1982 1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự liên quan giữa gen CYP21 với MHC nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37]. Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân tử khác như giải trình tự gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS đã được phát hiện [26]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS. Các công trình nghiên cứu có thể kể đến như: Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình và bệnh nhân [2]. Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương nhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao [1]. 3
Nhìn chung, ở Việt Nam những nghiên cứu về lâm sàng và ảnh hưởng tâm lý của gia đình và bệnh nhân là phổ biến, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh học phân tử bệnh TSTTBS. 1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Tần suất mắc bệnh trên thế giới là 1/10.000 1/15.000. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở hai quần thể người Eskimo Yupik (Alaska) và La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282 và 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu là 1/14.000 [28]. Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ được chẩn đoán mới, chiếm tỷ lệ 60,7% các bệnh lý tuyến thượng thận và chiếm 2% các bệnh lý di truyền vào điều trị tại khoa Nội tiết Chuyển hóa Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17]. 1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS Khi thiếu enzym, một hay nhiều con đường tổng hợp hormon bị tắc nghẽn và hormon dưới chỗ tắc không được sản xuất đủ, đặc biệt là cotisol. Cơ chế điều hòa ngược (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH, gây tăng sản tuyến thượng thận, kích thích các tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26]. 1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS Sự thiếu hụt enzym 21 OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận. Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt của 21 OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS được chia thành 3 thể khác nhau bao gồm: Thể mất muối; Thể nam hóa đơn thuần; Thể không cổ điển 2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 Vị trí gen CYP21 Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng nằm bên trong phức h ợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST 4
số 6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P n ằm xen k ẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ thể [18], [40]. Cấu trúc gen CYP21 Gen mã hóa cho enzym 21 OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2, có kích thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong vùng phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complexMAC) (cạnh gen HLA). Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó, CYP21A2P, nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B. Chức năng gen CYP21 Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21OH gồm 494 acid amin, có vai trò phiên mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các intron nối chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử này sẽ được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21OH [20]. 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự tương đồng nhau. Trình tự của gen giả CYP21A2P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh nhân TSTTBS. Điều này có thể giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới vi ệc các trình tự ở vùng gen giả CYP21A2P chuy ển sang CYP21A2 gây nên đột biến gen CYP21A2. Theo th ống kê, 95% các đột biến trên gen CYP21A2 là do chuyển đoạn từ gen giả CYP21A2P, 5% còn lại là do gen CYP21A2 bị đột biến. Các đột biến thường gặp trên gen CYP21A2 là xóa đoạn hoặc chuyển đoạn lớn (Large deletion/convertion), IVS 13A/C → G, I172N. Ngoài ra còn có các đột biến Q138X, R365W, R473W, P30L, del 8 bp cũng có tỷ lệ tương đối cao [28]. 5
2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS TSTTBS do thiếu enzym 21 OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên NST thường nên tuân theo quy luật di truyền Mendel. Bệnh chỉ xảy ra ở người mang đồng hợp tử gen lặn. Aa Aa AA Aa aa (25%) (50%) (25%) Hình 1.4. Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường 2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử chứa các đột biến gen CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận cao hơn những người bình thường không mang gen [19], [26]. 2.4. Phát hiện người lành mang gen bệnh Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính trạng ra ngoài. Người mang gen bệnh thường có dấu hiệu về lâm sàng hoặc sinh học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng phương pháp sinh hóa. Định lượng 17 OHP cho những người là thành viên của gia đình người bệnh, với 17 OHP 300 1499 ng/ml được chứng minh là dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng corticotropin (Lee HH el al 2000). 3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 3.1.1. Chẩn đoán xác định 6
Định lượng 3 sản phẩm cuối cùng của hormon vỏ thượng thận: Aldosteron, cortisol, và testosteron; 3 chất chuy ển hóa trong nước tiểu là 17 CS, 17 OHCS, pregnanetriol. Các xét nghiệm này không đặc hiệu bởi vì những thay đổi nồng độ các chất chuyển hóa trên có thể gặp trong u tuyến yên và u vỏ thượng thận [27], [28]. Định lượng 17 OHP: 17 OHP là chỉ số đặc trưng để chẩn đoán TSTTBS do thiếu enzym 21 OH và tăng nồng độ trong máu hoặc tăng nồng độ qua nghiệm pháp ACTH [28]. 3.1.2. Chẩn đoán phân biệt Dậy thì sớm thật đồng giới, trẻ trai có tinh hoàn phát triển cùng với dương vật, thể tích tinh hoàn > 4 ml. Nồng độ FSH và LH tăng cao, không có các rối loạn hormon khác. Dậy thì sớm giả khác giới ở trẻ gái do u thượng thận nam hóa (Carcinome). U thường lớn 3 6 cm. Phát hiện u nhờ các chẩn đoán hình ảnh. 17 CS nước tiểu tăng cao. Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tương tăng. 17 OHP máu không tăng. Khi làm test ức chế bằng dexamethason, nồng độ DHEA huyết tương và nồng độ 17 CS niệu đều không giảm, giúp chẩn đoán phân biệt với TSTTBS [28]. U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tương và 17 CS niệu không tăng. Buồng trứng đa nang: Nguyên nhân thường gặp nhất do tăng tiết androgen do buồng trứng, triệu chứng nam hóa ít gặp. Hay gặp nhất là triệu chứng rậm lông, bệnh nhân có thể mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp glucose. FSH và LH tăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tương tăng cao [28]. 3.2. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 7
3.2.1. Kỹ thuật PCR Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA mới bổ sung và cần phải có các mồi oligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và điều hòa bởi nhiệt độ. Giống như nhiều bệnh lý di truyền, PCR được sử dụng rộng rãi để khuếch đại gen CYP21A2 xác định các đột biến xoá đoạn và phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu. Tuy nhiên do gen giả CYP21A2P có tính tương đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2 không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với gen CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22]. 3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của cả deoxynucleotid và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau. 3.2.3. Kỹ thuật Souther blot Souther blot là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện đột biến xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn… Đây là phương pháp mất nhiều thời gian và công sức nhưng lại rất hiệu quả. 3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 8
Nguyên tắc của MLPA là sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả năng lai đặc hiệu với các phân tử DNA đích. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotid dài và ngắn [32]. Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC Holland): Kit gồm các probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với các đột biến mất đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ thể (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. 9
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21hydroxylase được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết Chuyển hóa Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương; các thành viên trong gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhân. 2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA). Máy điện di: Mupid (Nhật Bản). Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQBioRad (USA). Máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ). 2.2.2. Hoá chất Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử như để tách chiết DNA, điện di DNA được cung cấp từ hãng invitrogen). Hóa chất để thực hiện phản ứng MLPA: SALSA MLPA Kit P050 B2 CAH. Hãng MRC Holland, Amsterdam, HàLan. Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC Holland): Kit này gồm các Probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gene CYP21 gọi là P050 B2. 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được tiến hành tại Khoa Nội tiết Chuyển hóa Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương. Các xét nghiệm sinh học phân tử thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Thời gian nghiên cứu 1 năm: từ tháng 9 năm 2014 đến 9 năm 2015. 10
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng ý của đối tượng nghiên cứu: Tham gia tự nguyện vào nghiên cứu. Các thông tin của bệnh nhân và gia đình sẽ được đảm bảo bí mật. Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định đạo đức trong nghiên cứu Y sinh h ọc . 2.5. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang. 2.5.1. Thiết kế nghiên cứu 10 bệnh nhân và 22 thành viên gia đình bệnh nhân TSTTBS Xây dựng phả hệ Thu thập mẫu máu ngoại vi Tách chiết DNA Kỹ thuật MLPA xác định đột biến và xác định người lành mang gen bệnh Phân tích kết quả Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm 11
2.5.2.1. Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu và tách chiết DNA Bệnh nhân và các thành viên của gia đình bệnh nhân lấy 2 5 ml máu ngoại vi. Tách chiết DNA bằng Phenol Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform: Bước 1: Phá vỡ hồng cầu Bước 2: Rửa bạch cầu Bước 3: Phá vỡ bạch cầu Bước 4: Loại bỏ protein Bước 5: Tủa DNA và thu DNA 2.5.2.5. Kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn Tiến hành phản ứng MLPA + Bước 1: Biến tính DNA. + Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đích. + Bước 3: Nối 2 đầu probe + Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe). Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự gen để phân tích kết quả. 12
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA DNA mẫu máu của 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh và 22 thành viên gia đình sau khi tách chiết theo quy trình Phenol/ Chloroform/ Isoamyl Alcohol được đo nồng độ và độ tinh sạch đồng thời điện di đánh giá chất lượng DNA. Kết quả đo mật độ quang Các mẫu DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang học trên máy Nanodrop. Kết quả đo nồng độ của các mẫu DNA giao động trong khoảng 100 200 ng/µl và độ tinh sạch giao động trong khoảng 1,8 2,0. Kết quả kiểm tra DNA tổng số Song song với việc đo OD để đánh giá chất lượng của sản phẩm tách chiết thì DNA tổng số còn được điện di trên gel agarose 0,8%. P1 P2 P3 P4 P5 T1 T2 T3 T4 T5 Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số P1P5: Mẫu bệnh nhân; T1T5: Mẫu thành viên gia đình bệnh nhân Kết quả hình 3.2 cho thấy các mẫu DNA cho một băng sáng rõ nét, không băng phụ, không bị đứt gãy. 13
3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh Phân tích phả hệ của 10 bệnh nhân bệnh TSTTBS thể thiếu 21OH, có 22 thành viên gia đình được phân tích gen. Trong cac thanh viên gia đinh, co 10 ng ́ ̀ ̀ ́ ười mẹ và 10 người bố tỷ lệ: 91%. Em ruôt bênh nhân co 2 ng ̣ ̣ ́ ươi (ty lê 9%) đa đ ̀ ̉ ̣ ̃ ược phân tich gen, ́ trong đo: em trai: 4,5%, em gai: 4,5%. ́ ́ Tiến hành xác định đột biến gen trên nhóm bệnh nhân bằng kỹ thuật MLPA, kết quả cho th ấy: Đã phát hiện đượ c 6/10 bệnh nhân có đột biến xóa đoạ n exon. Tiến hành xác đị nh ngườ i lành mang gen b ệnh trên nhóm bố, mẹ và một số thành viên gia đình đã phát hiện đượ c tình trạng mang gen ở tr ạng thái dị hợp tử. Kết quả phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia đình MS01: Hình 3.3. Phả hệ gia đình số 01 Phả hệ của gia đình số 1 có 3 thế hệ, thế hệ thứ 1 và thứ 2 không có người bị bệnh. Ở thế hệ thứ 3, 1 con trai (III.5), 4 tuổi bị bệnh TSTTBS thể mất mu ối. Có mang gen đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 8 gen CYP21A2. Các anh, chị họ (III.1, III.2, III.3, III.4) của bệnh nhân không có biểu hiện bệnh. Bố (II.6) 27 tuổi và mẹ (II.5) 26 tuổi đều là người lành mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 8. 14
Người bình thường Ex4 C4B C4A E10P Ex1 Ex8 Ex3 I2P Ex6 E1P Y Bệnh nhân Ex3 Ex4 Y Ex1 Ex6 Ex8 Bố bệnh nhân Ex3 Ex4 Y Ex6 Ex8 Ex1 Mẹ bệnh nhân Ex3 Ex4 Ex6 Ex8 Ex1 Y Hình 3.4. Kết quả MLPA gia đình mã số 01 Hình ảnh phân tich gen băng ky thuât MLPA trên gen ́ ̀ ̃ ̣ CYP21A2 cho thấy ở người bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân không thấy xuất hiện các đỉnh tương ứng với exon 1 đến exon, vì vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ exon 1 đến 15
exon 8. Phân tích kết quả ở người bố và người mẹ bệnh nhân cho thấy các đỉnh của exon 1 đến exon 8 chỉ bằng 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố, mẹ bệnh nhân là người mang gen bệnh. Kết quả phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia đình MS02: Hình 3.5. Phả hệ gia đình số 02 Gia đình có con gái 2 tuổi bị bệnh TSTTBS thể mất muối, kiểu gen đột biến là đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Bố mẹ bệnh nhân có kiểu hình bình thường và đều mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Trong gia đình không ai mắc bệnh giống bệnh nhân. 16