Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu tơ và sâu xanh

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

128
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn gram dương, sinh tinh thể diệt côn trùng trong quá trình hình thành bào tử. Tuy là một loại vi khuẩn được phát hiện khá muộn nhưng Bt đã được nghiên cứu rất kỹ ở nhiều quốc gia khác nhau và chế phẩm Bt được sử dụng thành công nhất trong bảo vệ thực vật (Asano, 1996). Các tinh thể độc của Bt có thể diệt được nhiều loại côn trùng thuộc bộ 2 cánh (Diptera) bộ cánh cứng (Coleoptera) và bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và một số loại côn trùng khác. Sâu tơ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu tơ và sâu xanh

T¹p chÝ KHKT N«ng nghiÖp, TËp 1, sè 4/2003 TuyÓn chän c¸c chñng Bacillus thuringiensis cã kh¶ n¨ng diÖt s©u t¬ vµ s©u xanh Selection of Bacillus thuringiensis strains with insectidal activity against armyworm (Plutella xylostella) and diamondback moth (Heliothis armigera) NguyÔn ThÞ Ho i H 1, Ng« Giang Liªn2 Summary Over 20 species of natunally occurring insect - specific bacteria have been isolated from the soil, insects and plants, but only a few have been studied intensively. Much attention has been given to Bacillus thuringiensis, a species that produces microbial insecticed toxic to specific groups of insects. Insecticidal activity of four strains of Bacillus thuringiensis from the Museum of the Center of Applied Microbiology has been tested against Plutella xylostella and Heliothis armigera. Keywords: Bacillus thuringiensis strains, insectidal activity, Plutella xylostella, Heliothis armigera. . 1. Më ®Çu1 2. Nguyªn liÖu v ph−¬ng ph¸p Bacillus thuringiensis (Bt) l vi khuÈn Vi sinh vËt: C¸c chñng Bacillus gram d−¬ng, sinh tinh thÓ diÖt c«n trïng trong thuringiensis ®−îc nhËn tõ B¶o t ng Gièng qu¸ tr×nh h×nh th nh b o tö. Tuy l mét lo¹i vi chuÈn vi sinh vËt, Trung t©m C«ng nghÖ Sinh khuÈn ®−îc ph¸t hiÖn kh¸ muén nh−ng Bt ® häc, §¹i häc Quèc gia H Néi. Bèn chñng ®−îc nghiªn cøu rÊt kü ë nhiÒu quèc gia kh¸c Bacillus thuringiensis ký hiÖu l 8-2, AM4, H- nhau v chÕ phÈm Bt ®−îc sö dông th nh c«ng H1 v G3 nhÊt trong b¶o vÖ thùc vËt (Asano, 1996). C¸c Bèn chñng vi khuÈn n y ®Òu ch−a cã tinh tinh thÓ ®éc cña Bt cã thÓ diÖt ®−îc nhiÒu lo¹i thÓ h×nh th¸p ®«i v ®−îc nu«i cÊy trªn m«i c«n trïng thuéc bé 2 c¸nh (Diptera) bé c¸nh tr−êng lªn men nªu d−íi ®©y. ë nhiÖt ®é 30oC cøng (Coleoptera) v bé c¸nh vÈy l¾c 220 vßng/phót. Thêi gian nu«i cÊy thÝch (Lepidoptera) v mét sè lo¹i c«n trïng kh¸c. hîp cho tõng chñng biÕn ®éng tõ 30 - 40 giê. S©u t¬ (Plutella xylostella) v s©u xanh M«i tr−êng lªn men (g/l): (Heliothis armigera Hubner) l nh÷ng lo i s©u Bét ®Ëu t−¬ng: 15; g©y h¹i nghiªm träng cho c¸c lo¹i rau trång. Bét ng«: 10; V× vËy trong ph¹m vi b i b¸o n y chóng t«i ®Ò §−êng kÝnh: 20; cËp tíi kh¶ n¨ng sinh tr−ëng, t¹o th nh b o tö Cao nÊm men: 1; còng nh− kh¶ n¨ng diÖt s©u xanh v s©u t¬ cña Mét sè muèi kho¸ng. c¸c chñng Bt ®Ó chän ra c¸c chñng Bt cã kh¶ pH = 7,0. n¨ng diÖt c¸c lo¹i s©u n y. Ph©n tÝch ®Þnh l−îng protein theo ph−¬ng ph¸p Lowry (Lowry v cs, 1951) v ph©n tÝch ®Þnh tÝnh protein theo Laemmili (Laemmili v 1 Trung t©m CNSH- §H Quèc gia H Néi 2 cs, 1970). Khoa Sinh, §H Khoa häc Tù nhiªn- §HQG 260
TuyÓn chän c¸c chñng bacillus Thuringiensis... B¶ng 1. Kh¶ n¨ng diÖt s©u xanh v s©u t¬ cña c¸c chñng Bacillus thuringiensis 8-2, G3, AM4, H-H1 chøa c¸c nhãm gen Cry kh¸c nhau Chñng gièng LC50 sau 4 ng y xö lý SDS-PAGE S¶n phÈm S©u t¬ S©u xanh (kDa) PCR (Plutella xylostella) (Heliothis armigera) CrylA(a), Bacillus thuringiensis 8-2 0,42 1,09 130 CrylA(b) CrylA(a), Bacillus thuringiensis G3 0,.23 2,30 130 CrylA(b) CrylA(a), Bacillus thuringiensis AM4 0,87 3,44 130 CrylA(b) CrylA(a), Bacillus thuringiensis H-H1 0,07 4,15 130 CrylA(b) Sö dông kü thuËt PCR ®Ó nhËn diÖn gen armigera), s©u t¬ (Plutella xylostella) cña c¸c Cry cña Bt, sö dông cÆp måi ®Æc hiÖu LepIA, chñng ® tuyÓn chän. C¶ 4 chñng ®Òu cã LepIB v LepIIA, LepIIB b»ng ph−¬ng ph¸p LC50 t−¬ng øng l 0,07 - 0,87 ®èi víi s©u t¬, Asano (Asano, 1996). Trong khi ®ã ®èi víi s©u xanh LC 50 cña Thö nghiÖm sinh häc: do ViÖn B¶o vÖ chóng chØ ®¹t tõ 1,09 - 4,15, cao nhÊt l chñng thùc vËt thùc hiÖn. 8-2. §èi t−îng thÝ nghiÖm: S©u xanh v s©u t¬ Dïng måi (primer) chän läc nh»m t¹o ra tuæi 2 s¶n phÈm mang tÝnh ®Æc thï cña nh÷ng gen m ho¸ (encoding). C¸c måi n y mang ®Æc 3. KÕt qu¶ v th¶o luËn tr−ng nhãm, ®−îc sö dông ®Ó ph¸t hiÖn c¸c 3.1. KiÓm tra ho¹t tÝnh diÖt s©u cña 4 chñng ®o¹n ADN ®Æc thï trong chñng Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis. KÕt qu¶ cho thÊy 4 chñng vi Theo Dulmage (1981) viÖc s¶n sinh khuÈn Bacillus thuringiensis cho s¶n phÈm protein tinh thÓ ®éc cña Bacillus thuringiensis PCR t−¬ng øng víi 490 bp, 986 bp sö dông phô thuéc rÊt nhiÒu v o ®iÒu kiÖn nu«i cÊy v c¸c gen tinh thÓ CryIA(a), CryIA(b) tæng hîp th nh phÇn m«i tr−êng. VËy 4 chñng Bacillus protein cã träng l−îng ph©n tö 130kDa. thuringiensis ®Òu chøa tinh thÓ ®éc cã kh¶ Protein n y l tiÒn ®éc tè, d−íi t¸c dông cña n¨ng diÖt s©u nh− thÕ n o. Ph¶n øng (PCR) sÏ proteaza v pH kiÒm trong ruét Êu trïng sÏ x¸c ®Þnh ®−îc nhanh c¸c chñng nghi ngê biÕn th nh protein ®éc 67 KDa g©y ®éc ®èi Bacillus thuringiensis cã hay kh«ng cã ho¹t víi Êu trïng cña s©u xanh v s©u t¬ (Asano, tÝnh diÖt s©u (Asano, 1996; Jackson v cs, 1996; Wu v cs; 1985; Yamamodo vaf cs; 2000). 1983). S©u xanh (Heliothis armigera) v s©u t¬ (Plutella xylostella) g©y h¹i chñ yÕu cho rau KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 2 cho thÊy r»ng c¶ 4 thuéc hä c¶i (Brassciaceae) ®Æc biÖt l c¶i chñng vi khuÈn nãi trªn ®Òu t¹o b o tö sau 34 xanh v trªn c¸c rau m u kh¸c. KÕt qu¶ ghi ë - 40 giê nu«i cÊy v chñ yÕu ®¹t ®−îc kho¶ng b¶ng 1 l ho¹t tÝnh diÖt s©u xanh (Heliothis 0,66 - 0,78 x109 b o tö/ml. ChØ sè pH ban ®Çu 261
NguyÔn ThÞ Hoµng Hµ, Ng« Giang Liªn B¶ng 2. Kh¶ n¨ng sinh tr−ëng v t¹o th nh b o tö cña c¸c chñng Bacillus thuringiensis 8-2, G3, AM4, H-H1 trong nu«i cÊy ch×m. Chñng gièng H×nh Tæng sè Tû lÖ t¸ch pH thêi H m l−îng d¹ng tinh b o tö b o tö (%) ®iÓm cuèi protein thÓ (x109/ml) (µg/ml) Bacillus thuringiensis 8-2 Th¸p ®«i 0,62 70 8,0/40 giê 634 Bacillus thuringiensis G3 Th¸p ®«i 0,74 76 7,8/36 giê 726 Bacillus thuringiensis AM4 Th¸p ®«i 0,78 78 8,2/34 giê 600 Bacillus thuringiensis H-H1 Th¸p ®«i 0,66 72 7,6/40 giê 720 H×nh 1. Tinh thÓ ®éc cña chñng Bacillus thuringiensis ®−îc tuyÓn chän chôp d−íi kÝnh hiÓn vi quang häc (®é phãng ®¹i 1000 lÇn) l 7,0 (pH cña thêi ®iÓm 0 giê). pH gi¶m ®−îc chuyÓn ho¸ th nh c¸c s¶n phÈm trung xuèng khi c¸c chñng b−íc v o pha logarit l gian l c¸c axit h÷u c¬ v c¸c axit amin, sau 6,0 v pH t¨ng dÇn ®Õn 7,6 - 8,2 ë giai ®o¹n ®ã khi c¸c s¶n phÈm n y ®−îc tiªu thô hÕt th× kÕt thóc sù nu«i cÊy. Sù biÕn ®æi pH trong qu¸ pH cña m«i tr−êng t¨ng dÇn ®Õn 7,6 - 8,2 ë tr×nh nu«i cÊy c¸c chñng nãi trªn còng t−¬ng giai ®o¹n kÕt thóc. Së dÜ pH t¨ng l do h m tù nh− kÕt qu¶ cña nhiÒu nghiªn cøu kh¸c khi l−îng amoniac (NH3) ®−îc tÝch luü trong m«i trong m«i tr−êng cã ®−êng, ban ®Çu chóng tr−êng nu«i cÊy. Sö dông ph−¬ng ph¸p nhuém 262
TuyÓn chän c¸c chñng bacillus Thuringiensis... tiªu b¶n cã thÓ cho thÊy râ h×nh ¶nh tÕ b o Bacillus thuringiensis by PCR and isolation of d−íi kÝnh hiÓn vi quang häc: phÇn lín l c¸c tÕ unique insecticidal bacteria. Memories Fac. Agr. Hokkaido Univ. 19: 529-563. b o h×nh que, t¹o ®«i hoÆc chuçi, t¹o b o tö v Jackson. T. A. D. J. Saville., 2000. Bioassay of tinh thÓ. replicating Bacteria Against Soil-dweeling 4. KÕt luËn insect pests. In "Bioassay of entomopathogenic C¶ 4 chñng Bacillus thuringiensis 8-2, G3, microbes and nematodes" by A. Navon. K. R. S. Ascher. CABI Publishing. page 73-93. AM4, H-H1 ®Òu cã ho¹t tÝnh diÖt s©u t¬ kh¸ Laemmili U.K., 1970. Cleavage of structural cao. LiÒu l−îng g©y chÕt víi s©u t¬ LC50 protein during the assembly of the head of t−¬ng øng víi 4 chñng trªn l 0,42; 0,23; 0,87; bacteriophage T4. Nature (London) 277: 680- 0,07. Trong khi ®ã c¸c chñng n y cã ho¹t tÝnh 685. diÖt s©u xanh thÊp h¬n (LC50 t−¬ng øng l Lowry O.H., Rosebrough A.L. and Randall R.J., 1,09; 2,30; 3,44; 4,15). 1992. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. C¶ 4 chñng vi khuÈn nãi trªn ®Òu t¹o b o Padiman, M. tö sau 34 - 40 giê nu«i cÊy v ®¹t ®−îc l−îng Wu D, and chang N.F., 1985. synergism in b o tö kho¶ng 0,66 - 0,78 x109 b o tö/ml. mosquitotocidal activity of 26 and 65 kDa C¸c chñng Bt 8-2, Bt G3, Bt AM4 v Bt H- proeins from Bacillus thuringiensis is subsp, H1 ®Òu cã tinh thÓ h×nh th¸p ®«i v chøa c¸c israentensis Crystal FEBS -190: 232-236 gen CryIA(a), CryIA(b) tæng hîp protein cã Yamamodo I, Garcia. A., 1983. Immunologicol träng l−îng ph©n tö 130 kDa. properties of the entomocidol proteins of Bacillus thuringiensis and its insecticidal T i liÖu tham kh¶o activity. J. Invertebr. Pathol, 41: 122-130. Asano, S., 1996. Identification of cry gene from 263