Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC-MS trong chẩn đoán rối loạn phát triển giới tính do thiếu enzym 5α-reductase type 2

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU<br /> BẰNG GC-MS TRONG CHẨN ĐOÁN RỐI LOẠN PHÁT TRIỂN GIỚI TÍNH<br /> DO THIẾU ENZYM 5α-REDUCTASE TYPE 2<br /> Trần Thị Ngọc Anh*, Trần Thị Chi Mai**, Nguyễn Việt Hoa*, Trần Minh Điển***, Vũ Chí Dũng***,<br /> Greaves F. Ronda****<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Thiếu enzym 5α-reductase type 2 là một trong hai nguyên nhân thường gặp gây rối loạn phát<br /> triển giới tính ở nam giới cần được chẩn đoán sớm.<br /> Mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, kết quả phân tích steroid niệu của 12 bệnh nhân thiếu hụt<br /> enzym 5α-reductase type 2 được chẩn đoán dựa trên kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký<br /> khí khối phổ (GC-MS).<br /> Phương pháp nghiên cứu: Định lượng steroid trong mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của 30 bệnh nhân mắc rối<br /> loạn phát triển giới tính trong năm 2016 - 2018 bằng kỹ thuật GC-MS.<br /> Kết quả: 12 bệnh nhân nam được chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductase type 2 bằng kỹ thuật định lượng<br /> steroid niệu với đặc trưng là tỷ lệ 5α-THF/THF thấp. Các dấu hiệu lâm sàng điển hình ở bệnh nhân 5α-reductase<br /> type 2 như dương vật nhỏ, lỗ đái thấp thể nặng, bìu chẻ đôi.<br /> Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC-MS giúp chẩn đoán 12<br /> bệnh nhân mắc rối loạn phát triển giới tính thể thiếu enzym 5α-reductase type 2.<br /> Từ khóa: Rối loạn phát triển giới tính, thiếu 5α-reductase type 2, GC-MS.<br /> ABSTRACT<br /> APPLICATION OF GC-MS URINE STEROID METABOLOME IN DIAGNOSIS OF SEXUAL<br /> DEVELOPMENT DUE TO DEFICIENCY OF ENZYME 5α-REDUCTASE TYPE 2<br /> Tran Thi Ngoc Anh, Tran Thi Chi Mai, Nguyen Viet Hoa, Tran Minh Đien, Vu Chi Dung,<br /> Greaves F. Ronda<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 445-451<br /> Background: The deficiency of enzyme 5α-reductase type 2 is one of the two most common reasons causing<br /> 46, XY disorders of sexual development (DSD) in man which needs to be early diagnosed.<br /> Objectives: To describe clinical signs, biochemical and urinary steroid profiling of twelve patients with 5α-<br /> reductase type 2 deficiency diagnosed by gas chromatography- mass spectrometry (GC-MS) urine steroid analysis.<br /> Materials and methods: Random urine samples of 30 DSD patients in the period 2016-2018 were<br /> quantitated their steroid composition by GC-MS. The clinical and biochemical features of the twelve patients were<br /> also observed and described.<br /> Results: Among patients with DSD, twelve were diagnosed with 5α-reductase type 2 deficiency by GC-MS<br /> urinary steroid analysis. The 5α-THF/THF ratios of these patients were low. The clinical signs include: bifid<br /> scrotum, hypospadias servere, micropenis. The characteristic pattern of GC-MS urine steroid profiling helped to<br /> <br /> * Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, ** Trường Đại học Y Hà Nội,<br /> *** Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học RMIT – Australia<br /> Tác giả liên lạc: BS Trần Thị Ngọc Anh, ĐT: 0904395444, Email: ngocanhbm@gmail.com<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 445<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> confirm the diagnosis of 5α-reductase type 2 deficiency in these twelve DSD patients.<br /> Conclusions: For the first time in Viet Nam, twelve patients with DSD were diagnosed with 5α-reductase<br /> type 2 deficiency by GC-MS urine steroid analysis.<br /> Keywords: Disorders of sexual development (DSD), 5α-reductase type 2 deficiency, GC-MS.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ triển giới tính nhưng chỉ một số rất ít bệnh nhân<br /> được chẩn đoán xác định thiếu enzym 5α-<br /> Enzym 5α-reductase xúc tác phản ứng khử<br /> reductase type 2 nhờ gửi mẫu làm phân tích gen<br /> liên kết đôi giữa C4-C5 của vòng A nhân sterol<br /> tại nước ngoài.<br /> trên một số cơ chất trong đó có testosterone<br /> thành 5α-dihydrotestosterone (5α-DHT) - chất Mục tiêu<br /> có tác dụng mạnh hơn testosterone hơn 10 lần Mô tả đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và kết<br /> trên thụ thể của androgen. Thiếu enzym 5α- quả phân tích steroid niệu của 12 bệnh nhân mắc<br /> reductase type 2 là bệnh lý di truyền do đột biến thiếu hụt enzym 5α-reductase type 2 được phát<br /> gen SRD5A2 trên nhiễm sắc thể số 2 (2p23), gây hiện bằng định lượng steroid niệu theo phương<br /> giảm một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính của pháp GC-MS.<br /> enzym 5α-reductase. Đặc điểm lâm sàng nổi bật ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU<br /> ở bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 là dấu<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> hiệu nữ hóa ở trẻ nam mang nhiễm sắc thể 46,<br /> XY như bộ phận sinh dục không phân biệt được Nhóm bệnh<br /> nam và nữ với dương vật nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái Tiêu chuẩn lựa chọn<br /> thấp, ẩn tinh hoàn(5). Thiếu enzym 5α-reductase Bệnh nhân nam rối loạn phát triển giới tính<br /> type 2 là bệnh hiếm gặp, một số nước có tần xuất theo phân loại Chicago 2006(6) gồm bệnh nhân<br /> mắc cao hơn như Dominica, Thổ Nhĩ Kỳ và bộ phận sinh dục không rõ ràng, không phân<br /> Lebanon, Hy Lạp(8). Định lượng steroid niệu biệt nam và nữ; bệnh nhân bất thường về giải<br /> bằng GC-MS được sử dụng trên thế giới như<br /> phẫu cơ quan sinh dục trong và ngoài; bệnh<br /> một tiêu chuẩn chẩn đoán quan trọng thiếu hụt<br /> nhân phát triển không hoàn toàn về giải phẫu<br /> bẩm sinh các enzym tham gia tổng hợp hormon<br /> tuyến sinh dục.<br /> steroid trong đó có thiếu 5α-reductase type 2(5,7).<br /> Phân tích đột biến gen SRD5A2 được sử dụng để Tiêu chuẩn loại trừ<br /> khẳng định thiếu hụt 5α-reductase type 2(4,5). Một Bệnh nhân nữ, bệnh nhân đã chẩn đoán tăng<br /> số ca lâm sàng thiếu enzym 5α-reductase type 2 sản thượng thận bẩm sinh.<br /> được công bố với các triệu chứng thường gặp Thời gian lấy mẫu<br /> như dương vật nhỏ, lỗ đái thấp, bìu chẻ đôi, ẩn Từ tháng 1/2016 đến 5/2018.<br /> tinh hoàn, nữ hóa(4,5,8). Các đặc trưng về định<br /> Địa điểm lấy mẫu<br /> lượng steroid niệu bằng GC-MS được công bố ở<br /> Khoa Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền của<br /> bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 là tỷ lệ 5α-<br /> bệnh viện Nhi Trung ương và khoa phẫu thuật<br /> THF/THF (THF: tetrahydrocortisol), An/Et<br /> Nhi – bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức.<br /> (Androsterone/Etiocholanolone), 11-OH An/11-<br /> OH Et và 5α-THB/THB (THB: Nhóm chứng<br /> tetrahydrocorticosterone) thấp hơn so với giá trị 103 trẻ nam khỏe mạnh trong cộng đồng có<br /> tham chiếu(3,5,9). độ tuổi từ 3 tháng đến 12 tuổi, tương ứng với<br /> Tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức và bệnh nhóm bệnh để xây dựng khoảng tham chiếu<br /> viện Nhi trung ương, có nhiều bệnh nhân mắc steroid niệu giúp chẩn đoán thiếu 5α-reductase<br /> tăng sản thượng thận bẩm sinh và rối loạn phát type 2 (sử dụng trong Bảng 3).<br /> <br /> <br /> <br /> 446 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Mẫu bệnh phẩm hoàn toàn dung dịch sau tách chiết bằng khí ni<br /> Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên, thể tích >3 mL tơ. Tạo dẫn xuất oxim methylsilyl bằng<br /> bảo quản ở -200C đến khi phân tích. methoxyamine/pyridine 3%. Tạo dẫn xuất<br /> Phương pháp nghiên cứu trimethylsylil bằng trimethylsylin imidazol<br /> (TMSI). Tách chiết mẫu steroid bằng Iso-octan,<br /> Mô tả cắt ngang hàng loạt ca bệnh.<br /> mẫu được phân tích trên máy GC-MS 7890A của<br /> Thiết kế nghiên cứu hãng Agilent. Xây dựng đường chuẩn từ mẫu<br /> Thăm khám lâm sàng các triệu chứng lâm chuẩn steroid được phân tích cùng mẫu bệnh, áp<br /> sàng về đặc điểm giới tính (bộ phận sinh dục). dụng phần mềm Chem Station để tính nồng độ<br /> Làm xét nghiệm bộ nhiễm sắc thể. các steroid niệu cở mẫu bệnh dựa vào đường<br /> Định lượng FSH, LH, testosterone trên hệ chuẩn. Kỹ thuật có độ lặp lại CV đạt 1,01-7,72(%)<br /> thống miễn dịch tự động Roche Cobas e601. ở mẫu nước tiểu bình thường và 0,78-9,2(%) ở<br /> Định lượng steroid niệu cho tất cả các mẫu mẫu bệnh lý. Độ tái lặp CV đạt 10,16-14,53(%) ở<br /> nước tiểu của trẻ khỏe mạnh và bệnh nhân mắc mẫu bình thường và 12,51-16,95(%) ở mẫu bệnh<br /> rối loạn phát triển giới tính. lý. Giới hạn định lượng 0,05 - 0,27(µmol/L) và độ<br /> thu hồi của các sản phẩm chuyển hoá steroid đạt<br /> Xây dựng khoảng tham chiếu steroid niệu<br /> 90-115(%)(3).<br /> cho trẻ em bình thường về tỷ lệ 5α-THF/THF,<br /> An/ Et từ 103 trẻ nam khỏe mạnh. Trong đó Kết quả định lượng steroid niệu được tính ra<br /> THF, 5α-THF là sản phẩm chuyển hóa trong đơn vị µmol/L và µmol/mmol creatinine.<br /> nước tiểu của cortisol, An và Et là sản phẩm Đạo đức y học<br /> chuyển hóa của testosterone và 5α- Đề tài được hội đồng đạo đức y học trường<br /> dihydrotestosterone trong nước tiểu. Đại học Y Hà Nội thông qua, và được sự đồng ý<br /> So sánh kết quả bệnh nhân nam, mắc rối của người bệnh/gia đình người bệnh.<br /> loạn phát triển giới tính với khoảng tham chiếu, Xử lý số liệu<br /> phát hiện các trường hợp có tỷ lệ 5α-THF/THF, Bằng phần mềm thống kê Excel, SPSS, tính<br /> tỷ lệ An/ Et thấp hơn là những trẻ có nguy cơ giá trị khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán 5α-<br /> mắc thiếu hụt 5α-reductase type 2 (theo nghiên THF/THF và An/Et. Tính giá trị 5α-THF/THF và<br /> cứu của O.K. Chan và cộng sự)(4,5). An/Et ở bệnh nhân và so sánh với khoảng tham<br /> Tách chiết DNA phân tích đột biến gen chiếu xây dựng được từ 103 trẻ nam bình thường.<br /> SRD5A2 để khẳng định chẩn đoán khi có thể.<br /> KẾT QUẢ<br /> (Hiện tại 7 bệnh nhân đã được phân tích gen<br /> SRD5A2, 7/7 bệnh nhân có đột biến gây bệnh). Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh nhân<br /> thiếu 5α-reductase type 2<br /> Trang thiết bị<br /> Trong số 30 bệnh nhân rối loạn phát triển<br /> Hệ thống GC-MS của Agilent. Tủ lạnh, thiết<br /> giới tính làm định lượng steroid niệu có 12 bệnh<br /> bị làm khô bằng khí nitơ, tủ ấm, và các trang<br /> nhân nghi ngờ mắc thiếu enzym 5-reductase<br /> thiết bị cơ bản của phòng xét nghiệm. Hóa chất:<br /> type 2 có đặc điểm lâm sàng được thể hiện trong<br /> enzym glucuronidase, TMSI, methoxyamin,<br /> Bảng 1.<br /> vitamin C, acetat, HCl, Iso-octan của hãng<br /> 12/12 bệnh nhân là nam có bộ nhiễm sắc thể<br /> Merck, Sigma Aldrich, Kura.<br /> 46, XY, không phát hiện bất thường về mặt<br /> Quy trình định lượng steroid niệu bằng GC-MS nhiễm sắc thể. Dấu hiệu lâm sàng không phân<br /> Thủy phân steroid niệu liên hợp bằng enzym biệt được nam và nữ ngay từ khi mới sinh khiến<br /> glucuronidase và arylsulphatase. Tách chiết 6/12 bệnh nhân được cho là nữ. Hiện tại, các<br /> steroid tự do bằng cột Bond-Elut C18. Làm khô bệnh nhân đều có dương vật nhỏ hơn nhiều so<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 447<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> với tuổi, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp ở gốc dương Nồng độ FSH của 12/12 bệnh nhân trong giới<br /> vật, 1/12 bệnh nhân ẩn tinh hoàn một bên (bệnh hạn bình thường (Bảng 2).<br /> nhân số 4). Bốn bệnh nhân là anh em trong hai Kết quả định lượng steroid niệu bằng GC-MS<br /> gia đình, bệnh nhân số 7 và 10 là hai anh em 12/12 bệnh nhân có tỷ lệ 5α-THF/THF thấp<br /> ruột, bệnh nhân số 8 và 9 là anh em ruột, 8 bệnh hơn khoảng tham chiếu (Bảng 3).<br /> nhân còn lại trong gia đình chỉ có chị gái, em gái<br /> Tỷ lệ An/Et thấp ở 6 bệnh nhân có độ tuổi<br /> không phát hiện bất thường về rối loạn phát<br /> 6-13, tỷ lệ An/Et không xác định ở bệnh nhân<br /> triển giới tính. Hai bệnh nhân 11 và 12 chưa xuất<br /> dưới 6 tuổi do nồng độ An và Et dưới giới hạn<br /> hiện dấu hiệu dậy thì mặc dù đã 13 tuổi.<br /> định lượng.<br /> Bệnh nhân số 6 chưa làm xét nghiệm. Nồng<br /> độ testosterone và LH cao ở bệnh nhân số 4.<br /> Bảng 1: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2<br /> Bệnh Họ và tên NST Thời điểm Lâm sang Thời điểm<br /> nhân có dấu hiệu GC-MS<br /> 1 Đỗ Đăng Qu 46, XY Khi sinh Ngoại hình nam, dương vật rất nhỏ 0,5cm, lỗ đái thấp 6 tháng<br /> 2 Nguyễn Gia B 46, XY Khi sinh Dương vật