Ứng dụng lý thuyết đồ họa để lập các phương trình động học của phản ứng enzym: Phản ứng thủy phân xúc tác papain

T¹p chÝ Hãa häc, T. 42 (2), Tr. 133 - 138, 2004<br /> <br /> <br /> <br /> øng dông lý thuyÕt ®å thÞ ®Ó lËp c¸c ph ¬ng tr×nh<br /> ®éng häc cña ph¶n øng enzym:<br /> Ph¶n øng thñy ph©n xóc t¸c papain<br /> §Õn Tßa so¹n 6-9-2002<br /> TrÇn §×nh To¹i1, TrÇn Trung HiÕu2<br /> 1<br /> ViÖn Hãa häc, ViÖn Khoa häc v% C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> 2<br /> ViÖn Nghiªn cøu KiÕn tróc, Bé X©y dùng<br /> <br /> <br /> Summary<br /> By using the graphic theory the constant of reserve hydrolytic protein reaction<br /> catalyzed by papain have been calculated as follow:<br /> For the activation reaction:<br /> VM = 2.08 × 10-6 M.sec-1, k2 = 1.04 × 10-1.sec-1, Ks = 1,79 × 10-4 M,<br /> = 0.265, KA = 1.54 × 10-4 M.<br /> For the inhibition reaction:<br /> VM = 0.67 × 10-3 M.sec-1, Ks = 0.55 × 10-5 M,<br /> k2 = 33.5 sec-1 , Ki = 1.85× 10-3 M.<br /> <br /> <br /> I - Më ®Çu [E] - ký hiÖu nång ®é enzym cßn l¹i ch7a kÕt<br /> hîp víi c¬ chÊt,<br /> §iÒu quan träng trong nghiªn cøu ®éng hãa [P] - ký hiÖu nång ®é s¶n phÈm,<br /> häc, bao gåm c¶ ®éng häc xóc t¸c enzym, l4 [S] - ký hiÖu nång ®é c¬ chÊt,<br /> ph¶i x¸c lËp ®7îc ph7¬ng tr×nh ®Ó x¸c ®Þnh c¸c [ES] - ký hiÖu nång ®é phøc trung gian enzym -<br /> th«ng sè ®éng häc cña ph¶n øng. c¬ chÊt ®7îc t¹o th4nh do enzym kÕt hîp víi c¬<br /> Nãi chung, ®èi víi bÊt cø ph¶n øng enzym chÊt,<br /> n4o, cã thÓ x¸c lËp ph7¬ng tr×nh ®éng häc (thÝ k+1, k-1 - h»ng sè t¹o phøc v4 h»ng sè ph©n ly<br /> dô nh7 ph7¬ng tr×nh tèc ®é). phøc trung gian enzym - c¬ chÊt,<br /> ThÝ dô: Cã thÓ t×m ph7¬ng tr×nh tèc ®é ®èi k2 - h»ng sè tèc ®é ph¶n øng, cßn gäi l4 h»ng sè<br /> víi ph¶n øng enzym hai giai ®o¹n theo c¬ chÕ xóc t¸c.<br /> Michaelis–Menten theo nh7 sau (S§1): Tèc ®é cña ph¶n øng nªu trªn ®7îc biÓu<br /> k+1[S] k2 diÔn b»ng biÓu thøc sau:<br /> E+S ES E+P V = d[ES]/dt = k2[ES] . (1)<br /> k-1<br /> Khi ph¶n øng x¶y ra, nång ®é enzym gi¶m<br /> Trong ®ã: dÇn ®Ó t¹o phøc trung gian víi c¬ chÊt [ES], khi<br /> [E]0 - ký hiÖu nång ®é ban ®Çu cña enzym khi Êy nång ®é enzym cßn l¹i l4 [E]. Nh7 vËy, nång<br /> ph¶n øng ch7a x¶y ra, ®é tæng céng cña tÊt c¶ c¸c tr¹ng th¸i enzym<br /> <br /> 133<br /> trong ph¶n øng chÝnh l4 nång ®é ban ®Çu cña tr7íc, trong c¸c ph¶n øng enzym, l4 chiÒu ph¶n<br /> enzym khi ph¶n øng ch7a x¶y ra: øng dÉn ®Õn c¸c chÊt ban ®Çu hoÆc trung gian.<br /> [E]0 = [ES] + [E]. (2) - ®Ønh: l4 ®iÓm cho tr7íc cña ®å thÞ.<br /> Theo c«ng thøc (1), ®Ó t×m tèc ®é ph¶n øng, - Nh¸nh: l4 ®o¹n nèi 2 ®Ønh cña ®å thÞ.<br /> ph¶i tÝnh gi¸ trÞ cña biÓu thøc [ES].<br /> - ®7êng: l4 dgy liªn tôc c¸c nh¸nh cña ®å thÞ<br /> Sù biÕn ®æi nång ®é phøc trung gian ®7îc theo mét h7íng ®Õn ®Ønh cuèi cïng.<br /> viÕt b»ng biÓu thøc sau:<br /> - ®å thÞ mÆt ph¼ng: l4 ®å thÞ m4 trong ®ã c¸c<br /> d[ES]/dt = k+1[E] [S] - (k2 + k–1) [ES]. (3)<br /> nh¸nh kh«ng c¾t nhau.<br /> ë tr¹ng th¸i æn ®Þnh, nång ®é phøc trung - C¬ së: Trong tÝnh to¸n, lÊy mét ®Ønh n4o ®ã<br /> gian kh«ng thay ®æi: cña ®å thÞ l4m mèc, ®Ønh Êy gäi l4 c¬ së.<br /> d[ES]/dt = 0, - §Þnh thøc c¬ së: l4 tæng gi¸ trÞ cña tÊt c¶ c¸c<br /> suy ra k+1[E] [S] – (k2+ k –1) [ES] = 0. ®7êng (c©y) h7íng vÒ c¬ së.<br /> Tõ c¸c biÓu thøc (2), (3) cã thÓ tÝnh gi¸ trÞ b. BiÓu diÔn ®å thÞ ®èi víi ph¶n øng enzym<br /> cña biÓu thøc [ES]: BiÓu diÔn ®å thÞ ®èi víi ph¶n øng enzym<br /> k+1[E]0[S] [E]0[S] chÝnh l4 dïng c¸c mòi tªn ®Ó m« t¶ sù biÕn ®æi<br /> [ES] = _____________________ = _____________________ . c¸c chÊt trong ph¶n øng. ThÝ dô:<br /> (k2+k–1)+k+1[S] (k2+k–1)/k+1+[S]<br /> a b c<br /> Thay gi¸ trÞ cña biÓu thøc [ES] v4o c«ng A B C P<br /> thøc tèc ®é (1) sÏ ®7îc ph7¬ng tr×nh tèc ®é cña e f<br /> ph¶n øng enzym 2 giai ®o¹n theo c¬ chÕ<br /> Michealis–Menten (S§1) [1, 2, 3]:<br /> E F<br /> k2[E]0[S]<br /> V = ________________________ . Trong ®å thÞ n4y cã: c¸c ®Ønh A, B, C, E, F;<br /> (k2+ k–1)/k+1+[S] c¸c ®7êng ABCP, ABCF, ABE; c¸c nh¸nh AB,<br /> §Æt: VM = k2[E]0 , KM = (k2+ k–1)/k+1 , ta cã BC, CP, BE, CF t7¬ng øng víi c¸c gi¸ trÞ a, b,<br /> c, e, f.<br /> V [S]<br /> M<br /> ______________<br /> V= . (3) c. Mét sè (tÝnh chÊt) quy luËt c¬ b¶n cña lý<br /> KM + [S] thuyÕt ®å thÞ<br /> Ph7¬ng tr×nh (3) ®7îc gäi l4 ph7¬ng tr×nh<br /> Michealis–Menten, trong ®ã VM l4 tèc ®é cùc Gi¸ trÞ cña ®7êng ®å thÞ b»ng tÝch gi¸ trÞ<br /> cña tÊt c¶ c¸c nh¸nh:<br /> ®¹i cña ph¶n øng, KM l4 h»ng sè Michaelis.<br /> Trong thùc tÕ, ph¶n øng sÏ phøc t¹p h¬n khi §7êng (A F) cã gi¸ trÞ abf.<br /> enzym cã mét v4i trung t©m häat ®éng, cã khi Gi¸ trÞ cña hai nh¸nh song song b»ng tæng<br /> cßn dÉn ®Õn sai sè. §Ó gi¶m bít khã kh¨n trªn, gi¸ trÞ cña chóng<br /> trong mét sè tr7êng hîp cã thÓ øng dông lý<br /> thuyÕt ®å thÞ ®Ó gi¶i b4i to¸n ®éng häc nªu trªn. a a+b<br /> A B = A B<br /> II - øng dông lý thuyÕt ®å thÞ ®èi b<br /> víi ph¶n øng enzym Gi¸ trÞ cña c¸c nh¸nh cïng h7íng vÒ c¬ së<br /> b»ng tÝch gi¸ trÞ cña chóng<br /> 1. Mét sè kh¸i niÖm c¬ cña lý thuyÕt ®å thÞ<br /> øng dông cho ph¶n øng enzym [4] A a<br /> <br /> a. C¸c ®Þnh nghÜa B = ac<br /> - ®å thÞ: l4 hÖ thèng ®7êng nèi c¸c ®iÓm cho C c<br /> <br /> 134<br /> 2. øng dông lý thuyÕt ®å thÞ ®Ó t×m ph.¬ng nh¸nh song song b»ng tæng gi¸ trÞ cña chóng,<br /> tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng enzym ë tr¹ng do ®ã cã thÓ ®¬n gi¶n s¬ ®å trªn nh7 sau:<br /> th¸i æn ®Þnh k-1+k2<br /> Theo lý thuyÕt ®å thÞ, t×m tèc ®é ph¶n øng kk+1+1[S]<br /> enzym l4 t×m tÊt c¶ c¸c ®Þnh thøc c¬ së, tøc l4 [S]<br /> E+S ES P<br /> ®Þnh thøc tÊt c¶ c¸c tr¹ng th¸i enzym. Ph7¬ng<br /> tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng ®7îc biÓu diÔn t7¬ng C¸c ®Þnh thøc c¬ së:<br /> quan gi÷a c¸c ®Þnh thøc ®ã nh7 sau: DE = k-1+ k2 , DES = k+1[S] ,<br /> kr Dr k+1k2[S] k2 [E]0[S]<br /> V= [E]00 .<br /> [E] (4) .<br /> V= [E]0 =<br /> Ds k-1 + k2 + k+1 [S] (k-1+ k2)/ k+1 + [S]<br /> S =1<br /> Trong ®ã: Ds l4 ®Þnh thøc c¬ së cña tÊt c¶ c¸c VM [S]<br /> HoÆc V= . (3)*<br /> tr¹ng th¸i enzym, Dr l4 ®Þnh thøc c¬ së cña tÊt KM + [S]<br /> c¶ c¸c tr¹ng th¸i enzym dÉn ®Õn s¶n phÈm ph¶n<br /> øng, kr l4 h»ng sè tèc ®é ph¶n øng t7¬ng øng Nh7 vËy, øng dông lý thuyÕt ®å thÞ cho<br /> víi Dr. phÐp t×m ph7¬ng tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng<br /> enzym hai giai ®o¹n theo c¬ chÕ Michaelis–<br /> Tr7êng hîp ®å thÞ cã mét lèi ra (ph¶n øng Menten víi kÕt qu¶ trïng víi kÕt qu¶ gi¶i b4i<br /> cã mét s¶n phÈm): to¸n enzym theo ph7¬ng ph¸p th«ng th7êng<br /> kr Dr (ph7¬ng tr×nh 3).<br /> V= [E]00 . (5)<br /> Ds b. T×m phQ¬ng tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng enzym<br /> S =1 hai giai ®o¹n theo c¬ chÕ øc chÕ c¹nh tranh<br /> (S§2)<br /> Nh7 vËy, ®Ó t×m ph7¬ng tr×nh tèc ®é cña<br /> ph¶n øng enzym, cÇn x¸c ®Þnh c¸c ®Þnh thøc c¬ k+1[S] k2<br /> së cña tÊt c¶ c¸c tr¹ng th¸i enzym. E+S ES E+P<br /> k (S§2)<br /> 3. Mét sè thÝ dô vÒ øng dông lý thuyÕt ®å thÞ k+3 k-3 k-1-1<br /> ®Ó t×m ph.¬ng tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng +I<br /> enzym [4, 5] EI<br /> a. T×m phQ¬ng tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng enzym Trong d¹ng ®å thÞ, cã thÓ biÓu diÔn s¬ ®å<br /> hai giai ®o¹n theo c¬ chÕ Michaelis–Menten ph¶n øng nh7 sau:<br /> (S§1) k-1<br /> Cã thÓ biÓu diÔn s¬ ®å ph¶n øng trong d¹ng k-3 k+1[S]<br /> ®å thÞ nh7 sau: EI E ES (S§2*)<br /> k–1 k+3[I] k2 P<br /> k+1[S] Nh7 vËy, tèc ®é ph¶n øng enzym ®7îc biÓu<br /> E+S ES P (S§1*) diÔn b»ng biÓu thøc sau:<br /> k2<br /> k2DES<br /> V= [E]<br /> [E]00 .<br /> Theo lý thuyÕt ®å thÞ, cã thÓ viÕt tèc ®é ph¶n DE + DES +DEI<br /> øng enzym:<br /> k2DES Trong ®ã, ®Þnh thøc c¸c tr¹ng th¸i cña enzym:<br /> V = [E]0 . DE = k-3 (k–1 + k2),<br /> DE + DES DES = k-3k+1[S],<br /> Theo tÝnh chÊt 2 cña ®å thÞ th× gi¸ trÞ cña hai DEI = (k–1+ k2)k+3 [I],<br /> <br /> <br /> 135<br />  k+1k2 k-3[E]0[S] Ph7¬ng tr×nh ph7¬ng tr×nh Michaelis–<br /> V= . Menten cã d¹ng sau:<br /> k-3(k–1+k2)+k-3k+1[S]+k-3 (k–1+k2)[I]<br /> VM [S]<br /> Chia tö v4 mÉu cho k+1k-3 V= . (6)<br /> k2[E]0[S] [I]<br /> KM ( 1 + ) + [S]<br /> V= . Ki<br /> (k -1 + k 2 ) (k + k 2 ) k3 Trong ®ã:<br /> + [S] + -1 [I]<br /> k +1 k +1 k 3 Ki = k-3/k+3 , KM = (k–1+ k2)/k+1.<br /> <br /> c. T×m phQ¬ng tr×nh tèc ®é cña ph¶n øng enzym ba giai ®äan (S§3)<br /> k+1[S] k2 k3<br /> E+ S ES EA E + P2 (S§3)<br /> k–1 P1<br /> Trong d¹ng ®å thÞ, cã thÓ biÓu diÔn s¬ ®å ph¶n øng nh7 sau:<br /> k–1<br /> k+1[S] k2<br /> E ES EA (S§3)*<br /> k3 P1 P2<br /> <br /> DE = (k –1k3+ k2k3) = k3(k –1+k2), DES = k3k+1[S], DEA = k+1k2[S] .<br /> Tèc ®é t¹o s¶n phÈm cña ph¶n øng P2:<br /> k3DEA k+1k2k3 [E]0[S]<br /> V P2 =<br /> VP2 [E]<br /> [E]00 = .<br /> 2<br /> DE + DES + DEA k3(k –1+k2) + k3k+1[S] + k+1k2[S]<br /> Chia tö v4 mÉu cho k+1(k2+ k3):<br /> k2 k3/(k2 + k3) [E]0[S]<br /> VP2 ,<br /> P2 =<br /> (k -1 + k 2 ) k3 k3 k2<br /> + [S] + [S]<br /> k +1 (k 2 + k 3 ) (k 2 + k 3 ) (k 2 + k 3 )<br /> <br /> k2k3 /(k2 + k3) [E]0[S]<br /> V P2 =<br /> VP2 , (7)<br /> KM k3/(k2 + k3) + [S]<br /> VM[S]<br /> VP2 = . (7)*<br /> KM + [S]<br /> Trong ®ã:<br /> k2k3<br /> VM = [E]0 , (8)<br /> (k 2 + k 3 )<br /> k3<br /> KM = . (9)<br /> (k 2 + k 3 )<br /> Tèc ®é t¹o s¶n phÈm cña ph¶n øng P1:<br /> <br /> 136<br />  T7¬ng tù nh7 tÝnh tèc ®é t¹o s¶n phÈm cña ph¶n øng P2, tÝnh ®7îc tèc ®é t¹o s¶n phÈm P1 nh7 sau:<br /> k2DES k2k3k+1[S]<br /> VP1<br /> P1 =<br /> [E]<br /> [E]0 0 = [E]00 = VP2 .<br /> [E]<br /> DE + DES + DEA DE + DES + DEA<br /> <br /> 4. KÕt qu¶ øng dông ph.¬ng ph¸p ®å thÞ ®Ó C¸c h»ng sè ®éng häc cña ph¶n øng thñy<br /> gi¶i c¸c bBi to¸n ®éng häc cho ph¶n øng ph©n:<br /> thñy ph©n ®.îc xóc t¸c bëi papain VM = 0,67 . 10– 3 M.gi©y–1, Ks = 0,55 . 10– 5 M,<br /> Trong nhùa ®u ®ñ cã chøa bèn lo¹i protease k2 = 33,5 gi©y– 1, Ki = 1,85 . 10– 3 M.<br /> l4 papain, chymopapain, peptidase A v4 peptidase - Ho¹t hãa ph¶n øng thñy ph©n protein dù<br /> B. Trong ®ã, papain chiÕm h¬n 90% v4 l4 tr÷ xóc t¸c papain:<br /> enzym cã ho¹t tÝnh thñy ph©n m¹nh nhÊt [6, 7].<br /> VM = 2,08 . 10–6 M.gi©y–1, k2 = 1,04 . 10– 1gi©y–1,<br /> Papain l4 cystein proteinase, cã ký hiÖu<br /> ph©n läai E.C.3.4.22.2, mang tÝnh chÊt nh7 mét Ks = 1,79 . 10 – 4 M, = 0,265, KA = 1,54 . 10- 4 M.<br /> endopeptidase, ®ång thêi còng nh7 mét<br /> exopeptidase, thñy ph©n protein th4nh poly- III - KÕt LuËn<br /> peptit, oligopeptit v4 c¸c axit amin. TÝnh chÊt<br /> Lý thuyÕt ®å thÞ ®7îc øng dông cã hiÖu<br /> ®Æc hiÖu cña papain rÊt lín ®èi víi c¬ chÊt,<br /> qu¶ ®èi víi b4i to¸n ®éng häc xóc t¸c enzym,<br /> papain cã kh¶ n¨ng thñy ph©n tÊt c¶ c¸c liªn kÕt<br /> cho phÐp t×m c¸c ph7¬ng tr×nh ®éng häc mét<br /> peptit, trõ c¸c liªn kÕt cña prolin v4 axit<br /> c¸ch ®¬n gi¶n h¬n, nhanh chãng h¬n.<br /> glutamic. Papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ xanh cã<br /> ho¹t lùc thñy ph©n m¹nh ngang víi chÕ phÈm ®g øng dông ph7¬ng ph¸p ®å thÞ ®Ó gi¶i<br /> Substilizin Bungary v4 m¹nh h¬n chÕ phÈm c¸c b4i to¸n ®éng häc cho ph¶n øng thñy ph©n<br /> Neutrase cña hgng Novo §an m¹ch [7, 8]. V× ®7îc xóc t¸c bëi papain. KÕt qu¶ thu ®7îc theo<br /> vËy, papain ®7îc øng dông trong nhiÒu lÜnh vùc ph7¬ng ph¸p n4y trïng víi kÕt qu¶ gi¶i b4i to¸n<br /> cña nÒn kinh tÕ quèc d©n: trong c«ng nghiÖp enzym theo ph7¬ng ph¸p th«ng th7êng.<br /> thùc phÈm, c«ng nghiÖp nhÑ, trong y, d7îc.<br /> C«ng tr×nh n%y ®Qîc ho%n th%nh víi sù hç<br /> Nghiªn cøu quy luËt ®éng häc cña ph¶n<br /> trî t%i chÝnh cña ChQ¬ng tr×nh nghiªn cøu c¬<br /> øng thñy ph©n protein dù tr÷, xóc t¸c bëi<br /> b¶n trong lÜnh vùc khoa häc tù nhiªn.<br /> papain, trong ®ã bao gåm c¸c ¶nh h7ëng ho¹t<br /> hãa papain, cho phÐp hiÓu s©u b¶n chÊt cña c¸c<br /> qu¸ tr×nh ®Ó ®7a chóng v4o øng dông thùc tiÔn T5i liÖu tham kh¶o<br /> mét c¸ch cã hiÖu qu¶ t¹o ra nh÷ng s¶n phÈm cã 1. V. A. Iakovlev. §éng häc cña xóc t¸c enzym,<br /> gi¸ trÞ dinh d7ìng cao. Nauka, Moskva (1965) (tiÕng Nga).<br /> Chóng t«i ®g øng dông ph7¬ng ph¸p ®å thÞ 2. A. Cornish-Bowden. Principles of Enzyme<br /> ®Ó gi¶i c¸c b4i to¸n ®éng häc cho ph¶n øng Kinetic, Lecturer in Biochemistry, University<br /> thñy ph©n ®7îc xóc t¸c bëi papain [9, 10]. KÕt of Birmingham (1979).<br /> qu¶ thu ®7îc theo ph7¬ng ph¸p n4y trïng víi<br /> kÕt qu¶ gi¶i b4i to¸n enzym theo ph7¬ng ph¸p 3. D. L. Purich (Ed.). Enzyme Kinetics and<br /> th«ng th7êng. Mechanism, Part C: Intrmediates, Stereo-<br /> chiemistry and Rate Studies, Method in<br /> §g tÝnh to¸n c¸c h»ng sè ®éng häc cña c¸c Enzymology, Vol. 87, Academic Press,<br /> qu¸ tr×nh: Orlando (1982).<br /> - øc chÕ ph¶n øng thñy ph©n protein dù tr÷ 4. I. V. Berezin, A. A. Klecev. Gi¸o tr×nh thùc<br /> xóc t¸c papain: h4nh ®éng häc hãa häc v4 enzym, NXB §¹i<br /> Flavonoid øc chÕ papain theo c¬ chÕ c¹nh häc Tæng hîp Quèc gia, Moskva (1976)<br /> tranh. (tiÕng Nga).<br /> <br /> 137<br /> 5. TrÇn §×nh To¹i. §éng häc c¸c qu¸ tr×nh xóc Tr. 11 - 18 (2001).<br /> t¸c sinh häc, Tr7êng §¹i häc Khoa häc tù 9. TrÇn §×nh To¹i, TrÇn Trung HiÕu. T¹p chÝ<br /> nhiªn, §¹i häc Quèc gia H4 Néi (2004). Hãa häc, T. 41, sè 1, Tr. 14 - 18 (2003).<br /> 6. M. A. Noble, S. Gul, C. S. Verma, K. Broc- 10. TrÇn §×nh To¹i, TrÇn Trung HiÕu. “§éng<br /> klehurst. Biochem. J., Vol. 351, P. 723 - 733<br /> häc cña qu¸ tr×nh ho¹t hãa thñy ph©n protein<br /> (2000).<br /> dù tr÷, xóc t¸c bëi papain tõ nhùa qu¶ ®u<br /> 7. TrÇn §×nh To¹i, Lª §øc Ngäc, TrÇn §×nh ®ñ xanh”, TuyÓn tËp c¸c b¸o c¸o to4n v¨n<br /> Thanh. T¹p chÝ Hãa häc, T. 31, sè 4, Tr. 29 Héi nghÞ to4n quèc c¸c ®Ò t4i nghiªn cøu<br /> - 31 (1993). khoa häc c¬ b¶n trong lÜnh vùc hãa lý v4 hãa<br /> 8. TrÇn §×nh Thanh, Ho4ng Thanh H7¬ng, lý thuyÕt, Bé Khoa häc, C«ng nghÖ v4 M«i<br /> NguyÔn V¨n ViÖt, TrÇn §×nh To¹i. T¹p tr7êng, Ch7¬ng tr×nh Khoa häc c¬ b¶n, H4<br /> chÝ Hãa häc v4 C«ng nghÖ hãa chÊt, sè 7, Néi, th¸ng 4 n¨m 2002, Tr. 58 - 61 (2002).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 138<br />