Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học<br />
<br />
<br />
XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (SNP) CỦA GEN APC<br />
Ở BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH<br />
Nguyễn Thị Băng Sương*,**, Nguyễn Hữu Huy**, Lê Minh Khôi *,**, Nguyễn Trung Tín*,**,<br />
Nguyễn Hoàng Bắc*,**<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mở đầu: Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) là bệnh di truyền đặc<br />
trưng bởi sự hiện diện rất nhiều polyp tuyến ở đại tràng, thường trên 100 polyp. Theo Sheng và cộng sự, 100%<br />
bệnh nhân FAP không được điều trị sẽ dẫn đến ung thư đại tràng ở tuổi 35-40. Nguyên nhân gây nên FAP được<br />
xác định là do đột biến gen APC. Các đa hình ở gen APC nhạy cảm với ung thu. Tuy nhiên mối liên hệ giữa các<br />
đa hình gen APC và nguy cơ ung thư đại trực tràng vẫn chưa được biết rõ.<br />
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự xác định các SNP ở gen APC trên bệnh nhân FAP.<br />
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: 63 bệnh nhân có triệu chứng đa polyp tham gia nghiên cứu. Chúng<br />
tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự để phát hiện SNP ở gen APC.<br />
Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC. Trong đó 7/10 SNP không làm<br />
thay đổi acid amin nên các SNP này không làm thay đổi kiểu hình. Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm thay<br />
đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737<br />
(p.Ile2231Phe). Trong số đó, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) có nguy cơ cao gây ung thư đại trực tràng<br />
Kết luận: Chúng tôi phát hiện 3 SNP làm thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP<br />
rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Vai trò của các SNP này cần được làm rõ qua các<br />
nghiên cứu tiếp theo<br />
Từ khoá: FAP, gen APC, SNP, giải trình tự<br />
ABSTRACT<br />
MOLECULAR DIAGNOSIS OF FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS (FAP)<br />
Nguyen Thi Bang Suong, Nguyen Huu Huy, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Nguyen Hoang Bac<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 21 - No 3 - 2017: 115 - 119<br />
<br />
Background: Familial adenomatous polyposis-FAP is an inherited disorder characterized by the presence lot<br />
of adenomatous polyps in the colon, usually over 100 polyps. According to Sheng et al, 100% of patients with<br />
untreated FAP will lead to colon cancer at the age of 35-40. FAP is caused by germline mutations in APC genes.<br />
Adenomatous polyposis coli (APC) gene polymorphisms are believed to contribute to tumor susceptibility.<br />
However, the association between single-nucleotide polymorphisms (SNP) in the APC gene and colorectal cancer<br />
(CRC) susceptibility remains unknown<br />
Objective: Applying sequencing methods to detect SNPs of APC gene in FAP patients.<br />
Materials and Methods: 63 polyposis patients were recruited in the research. We use the sequencing<br />
method to detect SNPs in APC genes.<br />
Results: In this study, we found 10 SNPs in the APC gene. 7 of 10 SNPs do not change the amino acid<br />
<br />
* Đại học Y Dược TP.HCM, ** Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM<br />
Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT:0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com<br />
<br />
<br />
<br />
115<br />
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017<br />
<br />
sequence of a protein so there is no significant change in phenotype. However, there are 3 SNPs that change amino<br />
acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe).<br />
Among them, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) is associated with a high risk of colorectal cancer.<br />
Conclusion: We detected three SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP<br />
rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Their role should be clarified through<br />
further research.<br />
Key words: FAP, APC gene, SNP, sequencing<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ được báo cáo(3,2). Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng<br />
tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu: “Xác định<br />
Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary đa hình đơn nucleotide (SNP) gen APC ở bệnh<br />
familial adenomatous polyposis: FAP) là một nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình”<br />
bệnh rối loạn di truyền trội(6). Đa polyp tuyến gia<br />
đình được đặc trưng bởi sự phát sinh hàng trăm ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br />
đến hàng ngàn polyp trong đại trực tràng, hầu Đối tượng nghiên cứu<br />
hết là ở tuổi vị thành niên(6,7). Triệu chứng đầu Đây là bệnh hiếm gặp, tỷ lệ mắc bệnh<br />
tiên của FAP là tiêu chảy và có máu trong khoảng 1/10.000-1/6000, trong thời gian 2 năm<br />
phân(6). Bệnh xảy ra với tần suất là 1/8300 trẻ sinh nghiên cứu, chúng tôi thực hiện nghiên cứu trên<br />
ra và sống(2) và có nguy cơ cao dẫn đến ung thư 63 bệnh nhân mắc bệnh đa polyp gia đình.<br />
đại trực tràng, gần 100% bệnh nhân bị K hóa<br />
trước 40 tuổi nếu không được điều trị sớm(1). Phương pháp nghiên cứu<br />
Bệnh có liên quan mật thiết đến những đột Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi<br />
biến dòng mầm của gen ức chế khối u APC Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong<br />
(tumor - supressor adenomatous polyposis ống chống đông bằng EDTA nắp xanh dương và<br />
coligen: APC) nằm tại vị trí 5q21-q22(4,6). Gen được ly trích trong vòng 24 giờ. Sử dụng bộ kit<br />
APC là một gen ức chế khối u cổ điển dài 14000 QiAamp DNA blood mini kit của hãng Qiagen –<br />
nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa Đức để ly trích DNA.<br />
ra phân tử mRNA dài 8972 bp, sản phẩm dịch Sản phẩm ly trích được tiến hành kiểm tra<br />
mã dài 2843 acid amin. Các nghiên cứu trên thế độ nguyên vẹn của mạch bằng phương pháp<br />
giới đã tìm thấy khoảng 300 đột biến khác nhau<br />
điện di trên gel agarose 3%, đo nồng độ và độ<br />
trên gen APC gây bệnh FAP(2). Trong những năm<br />
tinh sạch bằng máy NanoDrop 2000. Chỉ những<br />
gần đây, nhiều nghiên cứu đã xác định tầm quan<br />
trọng của các đa hình đơn nucleotide (single mẫu tách chiết đạt độ tinh sạch với tỷ số<br />
nucleotide polymorphisms – SNP) bên cạnh đột A260/A280 trong khoảng 1,8-2,0 mới tiếp tục<br />
biến ở các gen liên quan đến ung thư đại trực được sử dụng cho các thí nghiệm sau.<br />
tràng. Một số SNP đóng vai trò trong sự phát Kỹ thuật khuếch đại các exon của gen APC<br />
triển của ung thư đại trực tràng do tác động của<br />
Dùng phương pháp PCR khuếch đại 15 đoạn<br />
nó đến chức năng các gen điều hòa hoạt động<br />
của tế bào. exon của gen APC bằng máy Gene Amp PCR<br />
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen System 9700 (USA).<br />
APC ở bệnh nhân FAP vẫn còn rất hạn chế. Năm Thành phần của phản ứng PCR gồm 20 μl<br />
2012 tác giả Nguyễn Phương Anh đã phân tích chứa các thành phần: DNA khuôn; 0,2 mmol/L<br />
gen APC cho một số gia đình bệnh nhân FAP và dNTP; 1,5 mmol/L Mg++; 0,1-0,2 μmol/L primer<br />
đã phát hiện các đột biến gây bệnh ở exon 15 của<br />
và 1-1,5 đơn vị Taq polymerase.<br />
gen APC tuy nhiên các SNP ở gen APC vẫn chưa<br />
<br />
<br />
116<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học<br />
<br />
<br />
Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Đầu Xử lý thống kê<br />
tiên là giai đoạn biến tính ở 94°C trong 5 phút, Số liệu thống kê được phân tích và xử lý<br />
tiếp theo là 35-40 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C bằng phần mềm SPSS 19.0.<br />
trong 30 giây; gắn mồi ở 60°C trong 30 giây và KẾT QUẢ - BÀN LUẬN<br />
bước kéo dài 72°C trong 30 giây, cuối cùng là giai<br />
Đặc điểm nhóm nghiên cứu<br />
đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút và bảo<br />
Bảng 1. Phân bố theo giới và tuổi của bệnh nhân<br />
quản tạm thời sản phẩm PCR ở 4°C.<br />
Nhóm tuổi Nam Nữ Chung hai<br />
Kết quả PCR sau đó được kiểm chứng bằng giới<br />
n Tỷ lệ % n Tỷ lệ % n Tỷ lệ %<br />
phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.<br />
Kỹ thuật giải trình tự gen Dưới 30 7 11,1 4 6,3 11 17,4<br />
Thực hiện phản ứng cycle sequencing với Từ 30 - 60 25 39,7 19 30,1 44 69,8<br />
Trên 60 8 12,7 0 0 8 12,7<br />
BigDye version 3.1 của công ty Applied<br />
Tổng số 40 63,5 23 36,5 63 100<br />
Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược, giải<br />
Nhận xét: Trong nhóm nghiên cứu thì<br />
trình tự DNA bằng máy sequencer ABI 3500.<br />
nhóm các bệnh nhân từ 30 đến 60 tuổi chiếm<br />
Phân tích kết quả giải trình tự đa số (69,8%), độ tuổi trung bình của bệnh<br />
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng nhân trong nhóm nghiên cứu là 43,9. Tỷ lệ<br />
phần mềm CLC Main Workbench 5 và so sánh bệnh nhân nam tham gia nghiên cứu là 63,5%<br />
với trình tự gen APC chuẩn có mã trình tự tham và nữ chiếm 36,5%.<br />
chiếu trên NCBI là NG_008481.4.<br />
Kết quả thống kê các SNP trên gen APC<br />
Bảng 2. Thống kê các SNP trên gen APC<br />
STT Exon chứa đột Nucleotide bị Acid amin bị thay đổi Mã SNP Số lượng kiểu gen<br />
biến thay đổi Dị hợp Đồng hợp<br />
1 3 c.317G>A p.Arg106His rs201764637 1 0<br />
2 11 c.1458 T>C p.Tyr486Tyr rs2229992 20 9<br />
3 13 c.1635 G>A p.Ala545Ala rs351771 13 5<br />
4 15 c.4479 G>A p.Thr1493Thr rs41115 25 13<br />
5 15 c.5034 G>A p.Gly1678Gly rs42427 14 8<br />
6 15 c.5268 T>G p.Ser1756Ser rs866006 24 11<br />
7 15 c.5465 T>A p.Val1822Asp rs459552 17 8<br />
8 15 c.5880 G>A p.Pro1960Pro rs465899 16 7<br />
9 15 c.6063 C>T p.Phe2021Phe rs786203342 22 10<br />
10 15 c.6691 A>T p.Ile2231Phe rs534228737 1 0<br />
Nhận xét: Chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở Kiểm tra trên cơ sở dữ liệu 1000genomes<br />
gen APC, trong đó 7/10 SNP không làm thay đổi (http://browser.1000genomes.org/), khi giải<br />
acid amin, các SNP này không có ý nghĩa về mặt trình tự 99 người dân tộc Kinh ở Việt Nam thì<br />
lâm sàng vì không ảnh hưởng đến cấu trúc không phát hiện hai SNP rs201764637<br />
protein. Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm (p.Arg106His) và SNP rs534228737<br />
thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Ile2231Phe) còn SNP rs459552<br />
(p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và (p.Val1822Asp) thì có 13 người dị hợp và 2<br />
SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). người đồng hợp. Điều này cho thấy SNP<br />
rs459552 (p.Val1822Asp) phổ biến trong quần<br />
<br />
<br />
117<br />
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017<br />
<br />
thể người Việt Nam nên không phải là SNP loại Counsyl (2015) thì SNP rs201764637 được<br />
gây bệnh. Tuy nhiên theo nghiên cứu xếp loại biến thể chưa có ý nghĩa rõ ràng<br />
Guerreiro vào năm 2017 cho thấy SNP (variant of uncertain significance - VUS) do chỉ<br />
rs459552 (p.Val1822Asp) có liên quan đến mới có 2 báo cáo về SNP này trên thế giới nên<br />
khẩu phần ăn và nguy cơ ung thư trực tràng chưa đủ dữ liệu để đánh giá ảnh hưởng của<br />
cụ thể những người có mang allen đột biến sẽ SNP lên kiểu hình bệnh.<br />
có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cao hơn Theo cơ sở dữ liệu ClinVar thì SNP<br />
nếu ăn khẩu phần ăn nhiều cholesterol, ít chất rs534228737 cũng được xếp loại biến thể chưa có<br />
xơ và canxi so với người có kiểu gen bình ý nghĩa rõ ràng. Tuy nhiên biến thể này cũng<br />
thường có khẩu phần ăn tương tự(3). Điều này không được tìm thấy khi giải trình tự 6500 người<br />
cho thấy các SNP có tương tác nhất định đối Mỹ gốc châu Âu và châu Phi trong dự án NHLBI<br />
với nguy cơ ung thư đại trực tràng. Exome Sequencing Project cho thấy SNP này<br />
Khi tiếp tục hồi cứu kết quả giải trình tự 2503 không phải là một biến thể lành tính thông<br />
người trên toàn thế giới thì thống kê của thường trong những quần thể này. Dựa trên<br />
1000genomes cho thấy chỉ có 2 trường hợp dị thông tin hiện có, chưa thể kết luận SNP<br />
hợp tử tương ứng với SNP rs201764637 rs534228737 là một đột biến gây bệnh hoặc một<br />
(p.Arg106His) và 2 trường hợp dị hợp tử đối với biến thể lành tính. Tuy nhiên đây là SNP thay<br />
SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Điều này chứng đổi acid amin p.Ile2231Phe nằm trong vùng cơ<br />
tỏ 2 SNP này có tỉ lệ rất thấp. bản của protein APC, là vùng có chức năng ổn<br />
Theo cơ sở dữ liệu ClinVar thì SNP định và kích thích sự trùng hợp vi ống tham gia<br />
rs201764637 (p.Arg106His) đã được Johnston trong quá trình phân chia tế bào. Cấu trúc của<br />
báo cáo từ năm 2012(3) và không có ý nghĩa rõ vùng này có tính bảo tồn rất cao.<br />
ràng về mặt lâm sàng. Theo tiêu chuẩn phân<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
Hình 1. Phân tích Polyphen-2 SNP rs534228737<br />
Phân tích SNP c.6691A>T bằng phần mềm KẾT LUẬN<br />
Polyphen-2 chúng tôi thu được số điểm nguy<br />
Bằng phương pháp giải trình tự, chúng tôi<br />
cơ của SNP là 0.997, đây là một số điểm rất<br />
đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC, trong đó 7/10<br />
cao, chứng tỏ SNP này có thể gây bệnh ở bệnh<br />
SNP không làm thay đổi acid amin, các SNP này<br />
nhân. Do vậy chúng ta cần theo dõi diễn tiến<br />
không có ý nghĩa về mặt lâm sàng vì không ảnh<br />
lâm sàng ở bệnh nhân cũng như theo dõi báo<br />
hưởng đến cấu trúc protein. Tuy nhiên, có 3 SNP<br />
cáo cập nhật của các tác giả khác nhau trên thế<br />
có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin đó là SNP<br />
giới về SNP này.<br />
<br />
<br />
118<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học<br />
<br />
rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 4. Leppert M, et al. (1987), "The gene for familial polyposis coli<br />
maps to the long arm of chromosome 5", Science, 238(4832),<br />
(p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 pp. 1411-3. 7<br />
(p.Ile2231Phe). Vai trò của các SNP này cần được 5. Nguyễn Phương Anh, Nguyễn Nghiêm Luật, and Trần Văn<br />
Khánh (2010), Nghiên cứu đột biến gene APC ở bệnh ung thư<br />
làm rõ qua các nghiên cứu tiếp theo.<br />
đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, Luận án tiến sỹ y<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO học, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội. 3<br />
6. Plawski A and Slomski R (2009), "APC gene mutations<br />
1. Guerreiro CS et al. (2007), "The D1822V APC polymorphism causing familial adenomatous polyposis in Polish patients", J<br />
interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the<br />
Appl Genet, 49(4), pp. 407–414. 1<br />
risk of colorectal cancer in Portuguese persons", The American 7. Poovorawan K, et al. (2012), "Colon Cancer Prevention by<br />
journal of clinical nutrition, 85(6), pp. 1592-1597. 5 Detection of APC Gene Mutation in a Family with Attenuated<br />
2. Half E, Bercovich D, and Rozen P (2009), "Familial Familial Adenomatous Polyposis", Asian Pacific J Cancer Prev,<br />
adenomatous polyposis", Orphanet J Rare Dis, 4(22Jian-Qiu 13(10), pp. 5101-5104. 6<br />
Sheng, et al. (2010), "APC gene mutations in Chinese familial<br />
adenomatous polyposis patients", World J Gastroenterol, 16(12),<br />
pp. 1522–1526. 2 Ngày nhận bài báo: 29/11/2016<br />
3. Johnston JJ et al. (2012), "Secondary variants in individuals Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/11/2016<br />
undergoing exome sequencing: screening of 572 individuals<br />
identifies high-penetrance mutations in cancer-susceptibility<br />
Ngày bài báo được đăng: 15/05/2017<br />
genes", The American Journal of Human Genetics, 91(1), pp.<br />
97-108. 4<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
119<br />