Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của Gà ri, Gà tre, Gà ác được nuôi ở Bắc Giang

Vũ Thị Như Trang và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 58(10): 86 - 89<br /> <br /> XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ TRE, GÀ<br /> ÁC ĐƯỢC NUÔI Ở BẮC GIANG<br /> Vũ Thị Như Trang*, Nguyễn Trọng Lạng<br /> Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên<br /> TÓM TẮT<br /> DNA ty thể (mtDNA) bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA và vùng<br /> điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter điều khiển sự tái bản và<br /> phiên mã mtDNA. Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA, dựa<br /> trên cơ sở đó có thể đánh giá mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền trong nghiên cứu<br /> giữa các quần thể của loài. Chúng tôi xác định được trình tự vùng điều khiển D-loop của<br /> 3 giống gà Ri, Ác, Tre gồm 1223 nucleotid và so sánh chúng với trình tự của gà<br /> Whitelergo gốc Anh thấy rằng giữa chúng có 15 điểm đa hình (đột biến).<br /> Từ khóa: DNA ty thể, vùng điều khiển D-loop, promoter, vùng tiến hóa<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Vũ Thị Như Trang và cs<br /> <br /> *<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> DNA ty thể (mtDNA) có dạng chuỗi kép, trần,<br /> mạch vòng và là vật chất di truyền nằm ngoài<br /> nhân di truyền theo dòng mẹ. DNA ty thể bao<br /> gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA,<br /> gen rRNA và vùng điều khiển – vùng không<br /> mã hoá duy nhất với các promoter để tái bản<br /> và phiên mã mtDNA. DNA ty thể có những<br /> đặc tính đáng quan tâm như sau: (1) Tỷ lệ<br /> tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn<br /> khoảng 5 lần so với bất kỳ một gen trong<br /> nhân nào. (2) mtDNA là một phân tử đơn bội<br /> mà không tái tổ hợp. Vùng điều khiển mtDNA<br /> là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA:<br /> chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn<br /> gấp 5–10 lần so với các gen khác của<br /> mtDNA, dựa trên cơ sở đó có thể đánh giá<br /> mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền trong<br /> nghiên cứu giữa các quần thể của loài. Trong<br /> bài báo này, chúng tôi công bố kết quả xác định<br /> trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của<br /> gà Ri, gà Tre, gà Ác được nuôi ở Bắc Giang.<br /> <br /> 58(10): 86 - 89<br /> <br /> của gà mà đầu 3’ của tiếp hợp vào (Desjadins<br /> và Morais, 1990) [3].<br /> - Tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) theo<br /> protocol của hãng Promega để thu sản phẩm<br /> PCR tinh sạch. Kiểm tra sản phẩm thôi gel<br /> trên gel agarose 0,8%.<br /> - Trình tự vùng D-loop được xác định dựa<br /> trên nguyên tắc chung của phương pháp<br /> Sanger [1], [2]. Vì đoạn gen cần xác định có<br /> chiều dài khoảng 1.3 kb nên chúng tôi đã xác<br /> định trình tự nucleotid từ hai chiều của tất cả<br /> các đoạn DNA có trong sản phẩm PCR nhờ<br /> cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định<br /> ®<br /> trình tự ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer.<br /> Sau đó chúng tôi sử dụng các phần mềm<br /> Seqscape & Bio Edit để kết hợp số liệu của<br /> hai chiều đọc và thu được trình tự hoàn chỉnh<br /> của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.<br /> Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí<br /> nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện<br /> Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và<br /> Công nghệ Việt Nam.<br /> <br /> 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> 2.1. Vật liệu<br /> <br /> 3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số<br /> từ máu gà<br /> <br /> Các mẫu máu được lấy từ các giống gà Ri,<br /> gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> - Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số theo<br /> Sambrook và Russell [6].<br /> - Điện di DNA theo phương pháp của Hồ<br /> Huỳnh Thùy Dương [1].<br /> <br /> Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách<br /> chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell<br /> [6]. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch trên gel<br /> agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện trên<br /> hình 1.<br /> <br /> - Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật<br /> PCR theo McPherson M.J. và Quirke P.,<br /> Taylor G.R. [4] bằng cặp mồi chuyên biệt là<br /> H1255- L16725 và đầy đủ các thành phần<br /> của phản ứng PCR.<br /> Trình tự của cặp mồi như sau:<br /> + Mồi xuôi H1255:<br /> 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC -3’<br /> + Mồi ngược L16725: 5’AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’<br /> Trong đó H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng<br /> (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ số là vị trí<br /> nucleotid trên mtDNA trong trình tự đầy đủ<br /> <br /> *<br /> <br /> Vũ Thi Như Trang, Tel: 01685 475 445,<br /> College of Education, Thai Nguyen University<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số<br /> 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3. Gà Tre<br /> Kết quả cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của<br /> gà Ri, Ác, Tre đều sáng tập trung và tương<br /> đối rõ nét. Ba băng DNA thu được có kích<br /> thước khoảng 21kb. Như vậy, có thể đánh giá<br /> DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Vũ Thị Như Trang và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 58(10): 86 - 89<br /> <br /> nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí<br /> nghiệm tiếp theo.<br /> 3.2. Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA<br /> ty thể<br /> Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã khuếch đại<br /> được vùng điều khiển D-loop. Sản phẩm PCR<br /> được kiểm tra trên gel agarose 0,8% với thể<br /> tích là 8 ml. Kết quả PCR được thể hiện trên<br /> hình 2.<br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> M: Marker DNA lamda;<br /> 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3. Gà Tre<br /> Kết quả cho thấy, cả 3 mẫu đều xuất hiện<br /> băng DNA có kích thước khoảng 1,3 kb, phù<br /> hợp với tính toán lý thuyết. Các băng sáng<br /> đậm, rõ nét, tập trung, chứng tỏ sản phẩm<br /> PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng<br /> D-loop. Sản phẩm PCR sẽ được sử dụng ở<br /> các thí nghiệm tiếp theo.<br /> 3.3. Xác định trình tự vùng điều khiển Dloop của DNA ty thể<br /> Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi<br /> tiến hành xác định trình tự đoạn D-loop trên<br /> máy đọc trình tự tự động trên cơ sở của<br /> phương pháp Sanger. So sánh trình tự của<br /> Ri, Ác, Tre với nhau và với trình tự D-loop<br /> của gà Whitelergo gốc Anh mã số AB114078<br /> [5]. Kết quả được thể hiện trên hình 3.<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Vũ Thị Như Trang và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 58(10): 86 - 89<br /> <br /> Hình 3. So sánh trình tự đoạn D-loop của 3<br /> mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà Whitelergo gốc Anh<br /> mã số AB114078<br /> So sánh trình tự của 3 mẫu gà nghiên cứu là<br /> gà Ri, gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang với<br /> trình tự tham khảo mã số AB114078 chúng<br /> tôi nhận thấy có 15 điểm đa hình/đột biến (tức<br /> là khác biệt nucleotid). Giữa 3 mẫu gà Ri, Ác,<br /> Tre còn khác biệt nhau ở 11 điểm đa hình<br /> (chiếm 0,9%). Mẫu gà Ác có 11 điểm (chiếm<br /> 0,9%), mẫu gà Ri có 4 điểm (chiếm 0,33%) và<br /> mẫu gà Tre có 13 điểm khác biệt so với trình<br /> tự tham khảo (chiếm 0,98%). Trong 15 điểm<br /> khác biệt này, phần lớn là đột biến thay thế.<br /> Riêng ở mẫu gà Ác, tại vị trí nucleotid số 1 bị<br /> mất nucleotid A so với trình tự tham khảo,<br /> đồng thời ở mẫu gà Tre tại vị trí nucleotid số<br /> 859 có thêm nucleotid là C trong khi trình tự<br /> tham khảo, mẫu gà Ri và mẫu gà Ác không<br /> có nucleotid này. Còn lại là các đột biến thay<br /> thế làm cho trình tự nucleoitd của các mẫu gà<br /> nghiên cứu khác với trình tự tham khảo như<br /> sau: thay thế A bằng C (A®C) tại vị trí<br /> nucleotid số 1 của mẫu gà Ri và gà Tre; thay<br /> thế C thành T (C®T) tại vị trí 167, 246, 315<br /> của mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 355 của cả<br /> 3 mẫu gà Ri, Ác và Tre, tại vị trí 219 của mẫu<br /> gà Tre; thay thế G thành A (G®A) tại vị trí<br /> 212, 1216 của 2 mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị<br /> trí 792 của mẫu gà Ác và 1193 của mẫu gà<br /> Tre; thay thế T thành C (T®C) tại vị trí 225<br /> của mẫu gà Ác và Tre; thay thế A thành T<br /> (A®T) tại vị trí 504, 992 của cả 3 mẫu gà Ri,<br /> Ác và Tre; thay thế A thành G (A®G) tại vị trí<br /> 1032 của mẫu gà Ác. Sự khác nhau về trình<br /> tự nucleotid của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre so với<br /> gà Whitelergo gốc Anh mã số AB114078<br /> được thống kê trên bảng 1.<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Vũ Thị Như Trang và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 58(10): 86 - 89<br /> <br /> Bảng 1. Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với gà Whitelergo gốc Anh mã số<br /> AB114078<br /> STT<br /> <br /> Mẫu gà<br /> <br /> Thay đổi nucleotid<br /> <br /> Vị trí trên ty thể<br /> <br /> Kiểu biến dị<br /> <br /> 1<br /> <br /> Ác<br /> <br /> del A<br /> <br /> 1<br /> <br /> Mất 1 nucleotid<br /> <br /> 2<br /> <br /> Tre, Ri<br /> <br /> A®C<br /> <br /> 1<br /> <br /> Dị hoán<br /> <br /> 3<br /> <br /> Ác, Tre<br /> <br /> C®T<br /> <br /> 167<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 4<br /> <br /> Ác, Tre<br /> <br /> G®A<br /> <br /> 212<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 5<br /> <br /> Tre<br /> <br /> C®T<br /> <br /> 219<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 6<br /> <br /> Ác, Tre<br /> <br /> T®C<br /> <br /> 225<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 7<br /> <br /> Ác, Tre<br /> <br /> C®T<br /> <br /> 246<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 8<br /> <br /> Ác, Tre<br /> <br /> C®T<br /> <br /> 315<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 9<br /> <br /> Ác, Tre, Ri<br /> <br /> C®T<br /> <br /> 355<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 10<br /> <br /> Ác, Tre, Ri<br /> <br /> A®T<br /> <br /> 504<br /> <br /> Dị hoán<br /> <br /> 11<br /> <br /> Tre<br /> <br /> Thêm C<br /> <br /> 859<br /> <br /> Thêm 1 nucleotid<br /> <br /> 11<br /> <br /> Ác<br /> <br /> G®A<br /> <br /> 792<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 12<br /> <br /> Ác, Tre, Ri<br /> <br /> T®C<br /> <br /> 992<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 13<br /> <br /> Ác<br /> <br /> T®C<br /> <br /> 1032<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 14<br /> <br /> Tre<br /> <br /> G®A<br /> <br /> 1193<br /> <br /> Đồng hoán<br /> <br /> 15<br /> <br /> Ác, Tre<br /> <br /> G®A<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> 1. Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số<br /> từ máu gà thuộc 3 giống gà Ri, Ác, Tre. Nhân<br /> bản thành công vùng D-loop của 3 giống gà<br /> này với kích thước khoảng 1,3 kb bằng kỹ<br /> thuật PCR nhờ cặp mồi H1255-L16725.<br /> 2. Xác định được trình tự vùng điều khiển Dloop gồm 1223 nucleotid của 3 mẫu gà<br /> nghiên cứu Ri, Ác, Tre và phát hiện được 15<br /> điểm đa hình về nucleotid giữa trình tự tham<br /> khảo mang mã số AB114078 với 3 giống gà<br /> nghiên cứu.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học<br /> phân tử, Nxb Giáo dục.<br /> <br /> 1216<br /> Đồng hoán<br /> [4]. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R.<br /> (1991), PCR – A Pratical Approach, IRL<br /> Press at Oxford University Press.<br /> [5]. Komiyama T., Ikeo K. and Gojobori T.,<br /> (2004), “The evolutionary origin of longcrowing chicken: its evolutionary relationship<br /> with fighting cocks disclosed by the mtDNA<br /> sequence analysis”, Gene 333, pp. 91-99,<br /> GenBank, Accession AB114078.<br /> [6]. Sambrook J., Russell D. W (2001),<br /> Molecular Cloning: A labroratory manual,<br /> Cold Spring Harbor labroratory press, New<br /> York.<br /> <br /> [2]. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương<br /> pháp sinh học phân tử, Nxb ĐHSP.<br /> [3]. Desjardins P., Morais R., (1990),<br /> “Sequence and gene ogranization of the<br /> chicken mitochondrial genome”, J. Mol. Biol.<br /> 212, pp. 599-634.<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />