Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao

KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> <br /> <br /> Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside<br /> trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC<br /> và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao<br /> Trần Trung Nghĩa1, Nguyễn Văn Tài2, Lê Hùng Tiến1, Lê Chí Hoàn1,<br /> Phạm Thị Lý1, Nguyễn Văn Kiên1, Nguyễn Thu Trang2, Phan Thị Trang2<br /> 1 Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ; 2 Viện Dược liệu<br /> <br /> Nhận bài ngày 05/11/2017, Phản biện xong ngày 27/12/2017, Duyệt đăng ngày 28/12/2017<br /> <br /> <br /> <br /> TÓM TẮT<br /> <br /> <br /> P hương pháp định lượng các bacoside tính theo bacoside A3 trong rau đắng biển<br /> (Bacopa monnieri (L.) Wettst) bằng HPLC-UV được xây dựng và thẩm định. Điều<br /> kiện phân tích được thực hiện trên cột pha đảo VertisepTM C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm),<br /> bước sóng phát hiện 205 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Khoảng tuyến tính của phương<br /> pháp phân tích bacoside là 13,5-270 µg/ml (r2=0,9999). Phương pháp cho độ đúng và<br /> độ lặp lại cao. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 2,70<br /> µg/ml và 8,91 µg/ml. Phương pháp này được áp dụng để xác định hàm lượng bacoside<br /> trong một số mẫu rau đắng biển, kết quả cho thấy hàm lượng bacoside trong khoảng<br /> 1,71–4,45%, mẫu có hàm lượng bacoside cao nhất là mẫu RĐB 2-13 (4,45 ± 0,02%).<br /> Từ khóa: Rau đắng biển, định lượng bacoside, HPLC<br /> <br /> <br /> 1. Đặt vấn đề và tác dụng dược lý của rau đắng biển. Kết<br /> Rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) quả nghiên cứu cho thấy rau đắng biển được<br /> Wettst) còn có tên gọi khác là rau sam đắng. sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để<br /> Từ lâu, loài cây này đã được sử dụng rất phổ điều trị các chứng tâm phiền khác nhau. Rau<br /> biến trong đời sống của con người như dùng đắng biển có chứa alkaloid brahmine, nico-<br /> làm rau ăn hoặc dùng làm thuốc trong y học tinine, herpestine, bacosides A [3-(α-L-arab-<br /> cổ truyền Ấn Độ từ 3000 năm trước, có tác inopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside-10,<br /> dụng bảo vệ trí nhớ, bổ thần kinh và tăng 20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-ene], sa-<br /> cường nhận thức, hiện đang được nghiên ponin triterpenoid, saponin A, B và C, axit<br /> cứu theo hướng để bảo vệ thần kinh [2], [4]. betulinic, D-mannitol, stigmastanol, β-sit-<br /> Hiện nay, nhiều tác giả trong và ngoài osterol, stigmasterol và pseudojujubogenin<br /> nước đã nghiên cứu về thành phần hóa học glycoside. Các nghiên cứu dược lý cho thấy<br /> <br /> 86  Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017<br />  KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> rau đắng biển có nhiều tác dụng dược lý, bao Bảng 1. Danh sách các mẫu dược liệu nghiên cứu<br /> gồm các phản ứng thần kinh trung ương TT Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu<br /> (tăng cường trí nhớ, chống trầm cảm), giảm 1 RĐB 01<br /> 2 RĐB 02 Thanh Hóa<br /> đau, chống co giật, chống oxy hóa, tiêu hóa, 3 RĐB 03<br /> nội tiết, chống vi khuẩn, chống viêm, giảm 4 RĐB 04<br /> đau, tim mạch và các tác động làm giãn cơ 5 RĐB 05 Nghệ An<br /> 6 RĐB 06<br /> trơn. Tổng quan hiện tại tập trung vào các 7 RĐB 07<br /> thành phần hóa học và hiệu quả dược lý của 8 RĐB 08 Đà Nẵng<br /> 9 RĐB 09<br /> rau đắng biển [1], [3], [5-7]. 10 RĐB 10 Lấp Vò - Đồng Tháp<br /> Ở Việt Nam hiện có dược phẩm “Ích Trí 11 RĐB 11<br /> Vũng Tàu<br /> Mộc Linh” (công ty Dược phẩm Tuệ Linh) 12 RĐB 12<br /> 13 RĐB 13<br /> được kết hợp từ rau đắng biển với các thảo 14 RĐB 14 Long An<br /> dược khác có tác dụng cải thiện trí nhớ, tăng 15 RĐB 15<br /> 16 RĐB 16<br /> khả năng tập trung, giảm căng thẳng và tình 17 RĐB 17<br /> Đồng Tháp<br /> trạng lo lắng, khắc phục tình trạng hay quên, 18 RĐB 18 TP. Hồ Chí Minh<br /> chứng lơ đãng, tăng cường sức khỏe và khả 19 RĐB 2-01<br /> 20 RĐB 2-02<br /> năng miễn dịch. 21 RĐB 2-03<br /> Tuy nhiên, vẫn chưa có vùng sản xuất 22 RĐB 2-04<br /> 23 RĐB 2-05<br /> dược liệu rau đắng biển ở Việt Nam, chỉ dựa 24 RĐB 2-06<br /> vào khai thác tự nhiên. Nghiên cứu này có 25 RĐB 2-07<br /> mục tiêu xây dựng được phương pháp định 26 RĐB 2-08<br /> 27 RĐB 2-09 Trung tâm Nghiên cứu dược liệu<br /> lượng hàm lượng bacoside trong rau đắng 28 RĐB 2-10 Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa)<br /> biển bằng HPLC, đồng thời đánh giá được 29 RĐB 2-11<br /> 30 RĐB 2-12<br /> hàm lượng bacoside của các mẫu rau đắng 31 RĐB 2-13<br /> biển thu từ các địa phương khác nhau và 32 RĐB 2-14<br /> sau khi trồng nhân giống tại cùng địa điểm 33 RĐB 2-15<br /> 34 RĐB 2-16<br /> nhằm tuyển chọn được các dòng có hàm 35 RĐB 2-17<br /> lượng bacoside cao, đáp ứng được yêu cầu 36 RĐB 2-18<br /> sản xuất nguồn dược liệu này.<br /> gồm 18 mẫu ký hiệu từ RĐB 01 đến RĐB 18.<br /> 2. Vật liệu và phương pháp Thu mẫu rau đắng biển sau khi nhân giống<br /> nghiên cứu và trồng tại Trung tâm Nghiên cứu dược liệu<br /> 2.1. Vật liệu nghiên cứu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa), ký hiệu từ RĐB<br /> Các mẫu dược liệu (toàn cây) rau đắng 2-01 đến RĐB2-18 (Bảng 1).<br /> biển do Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> Trung Bộ – Viện Dược liệu thu thập. Thu 2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương<br /> thập mẫu nghiên cứu và định danh đúng loài pháp định lượng tổng bacoside trong dược<br /> (Bacopa monnieri (L.) Wettst, đúng bộ phận liệu rau đắng biển<br /> dùng (toàn cây). Thu mẫu rau đắng biển tại Dung dịch chuẩn: Hòa tan bacoside A3<br /> các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam chuẩn trong methanol và pha loãng để tạo<br /> <br /> Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017  87<br /> KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> thành dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 235 tiêm mẫu…. để tìm ra chương trình định<br /> ppm. Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch lượng phù hợp nhất.<br /> chuẩn gốc này bằng methanol để thu được b) Thẩm định phương pháp định lượng<br /> các dung dịch có nồng độ từ 11,75–235 ppm. HPLC<br /> Các dung dịch chuẩn được lọc qua màng lọc ■■ Tính thích hợp của hệ thống<br /> có kích cỡ 0,45 µm thu được dung dịch dùng Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây<br /> để triển khai sắc ký. theo quy trình phân tích:<br /> Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện<br /> 2,5 g bột dược liệu rau đắng biển, chiết hồi trong khoảng thời gian lưu tương ứng với<br /> lưu với methanol đến khi dịch lọc nhạt màu. thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ. Nếu có<br /> Lọc dịch chiết vào bình định mức, bổ sung đáp ứng pic phải ≤1,0% so với đáp ứng pic<br /> dung môi đến vạch. Sau đó, lọc dịch chiết của mẫu chuẩn.<br /> qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm thu được dung Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có<br /> dịch thử dùng để triển khai sắc ký. thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa<br /> • Cột tách: Vertisep C18 (250 mm × 4,6 thống kê đối với pic của chất chuẩn trên sắc<br /> mm, 5 µm). ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ dung<br /> • Detector UV-Vis: bước sóng 205 nm. dịch thử, nếu xuất hiện thêm các pic khác<br /> • Pha động: Dung dịch đệm (A)– không phải pic của chất chuẩn thì phải tách<br /> Acetonitril (B). hoàn toàn khỏi pic và đáp ứng các yêu cầu<br /> • Dung dịch đệm pH 2,15 (A): Hòa tan chung của phương pháp sắc ký lỏng được<br /> 0,07 g KH2PO4 khan và 0,3 ml H3PO4 quy định trong Dược điển Việt Nam.<br /> 85% trong nước cất, định mức chính ■■ Tính thích hợp của hệ thống<br /> xác thành 500 ml, lắc đều, lọc, siêu âm Thực nghiệm:<br /> loại bọt khí. Dung dịch chuẩn: tiến hành sắc ký lặp lại<br /> Pha động được rửa giải theo chương trình 06 lần.<br /> gradient trình bày trong bảng 2. Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và<br /> xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic,<br /> Bảng 2. Chương trình gradient rửa giải hệ số đối xứng. Thời gian lưu có RSD ≤1,0%,<br /> pha động diện tích pic có RSD ≤2,0%.<br /> Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%) ■■ Khoảng tuyến tính<br /> 0 70 30<br /> 25 60 40<br /> Thực nghiệm:<br /> 26 70 30 Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn có nồng độ<br /> 30 70 30 từ 13,5-270 ppm bằng cách pha loãng từ một<br /> dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số<br /> • Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các<br /> • Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch lặp lại 03<br /> • Nhiệt độ cột: 28oC. lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng<br /> a) Xây dựng phương pháp định lượng của pic.<br /> Tiến hành các khảo sát về dung môi, Xác định phương trình hồi quy tuyến<br /> thành phần pha động, tốc độ dòng, thể tích tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng<br /> <br /> 88  Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017<br />  KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic cần phân tích. Nồng độ của chất cần phân<br /> thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp tích trong dung dịch thử (C, ppm) = [(S-a)/b]<br /> bình phương tối thiểu. xH/100. Với S là diện tích pic bacoside; a,b là<br /> ■■ Độ thu hồi các hệ số của phương trình đường chuẩn; H<br /> Độ đúng của phương pháp hay tỷ lệ thu là độ tinh khiết của chất chuẩn (%).<br /> hồi (%) = Khối lượng hoạt chất thu hồi/Khối Hàm lượng chất phân tích trong dược<br /> lượng hoạt chất thêm vào × 100. Nếu phương liệu (%) = [(C×100×100)/(m×1000000)]×[100/<br /> pháp đúng, tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: (100-a). Với C: nồng độ bacoside trong dung<br /> 97,0-103,0%, RSD tỷ lệ thu hồi (≤2,0%) ở mỗi dịch mẫu thử, xác định được bằng đường<br /> mức nồng độ. chuẩn (ppm); m: khối lượng dược liệu (g); a:<br /> ■■ Độ lặp lại độ ẩm dược liệu (%).<br /> Tiến hành định lượng 06 mẫu thử độc lập, 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu<br /> mỗi mẫu lặp lại 03 lần. Tập hợp kết quả và loại bỏ giá trị thô theo<br /> Xác định hàm lượng hoạt chất có trong test Dixon.<br /> các mẫu thử bằng cách sử dụng đường<br /> chuẩn ở mục xác định khoảng tuyến tính. 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận<br /> Độ lặp lại của phương pháp được xác định 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng<br /> bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng Chúng tôi tiến hành sắc ký các dung dịch<br /> hàm lượng bacoside trong mẫu. Nếu phương mẫu thử, mẫu chuẩn và dung môi pha mẫu<br /> pháp đúng, giá trị RSD (%) kết quả định theo điều kiện đã mô tả ở trên. So sánh thời<br /> lượng hàm lượng bacoside có trong các mẫu gian lưu của pic bacoside A3 chuẩn. Kết quả<br /> ≤2,0%. nghiên cứu được trình bày ở hình 1.<br /> ■■ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không<br /> Giới hạn phát hiện (LOD): Tiến hành pha xuất hiện pic bacoside A3 ở trong khoảng<br /> loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu<br /> HPLC đến khi tín hiệu của chất định phân của pic bacoside A3 trên sắc ký đồ của dung<br /> tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N dịch chuẩn.<br /> (tín hiệu/nhiễu) = 2H/h đạt khoảng từ 2–3, Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có<br /> trong đó H là chiều cao pic định phân tích, thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa<br /> h là chiều cao tín hiệu nhiễu nền lớn nhất. thống kê so với pic của chất chuẩn bacoside<br /> Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện A3 trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Trên sắc ký<br /> (LOD) của phương pháp ứng với từng chất đồ dung dịch thử không xuất hiện thêm các<br /> định phân tích. pic khác (pic tạp) ảnh hưởng đến pic chuẩn<br /> Giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn định bacoside A3.<br /> lượng của phương pháp được xác định dựa Pic của bacoside A3 trong sắc ký đồ dung<br /> trên giới hạn phát hiện. LOQ=3,3 × LOD. dịch chuẩn và thử tinh khiết. Hệ số tinh<br /> 2.2.2. Định lượng các mẫu rau đắng biển khiết pic bacoside A3 trong sắc ký đồ dung<br /> Tiến hành sắc ký riêng biệt các dung dịch chuẩn và dung dịch thử xấp xỉ 1,0.<br /> dịch mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi Như vậy, phương pháp đã chọn có tính<br /> nhận sắc ký đồ và ghi lại đáp ứng của chất đặc hiệu cao với bacoside A3 và có thể dùng<br /> <br /> Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017  89<br /> KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu<br /> A: Mẫu thử; B: bacoside A3 chuẩn, C: dung môi<br /> <br /> <br /> để phân tích thành phần hợp chất bacoside 3.1.2. Độ tuyến tính<br /> A3 trong dược liệu rau đắng biển. Chúng tôi tiến hành sắc ký theo điều kiện<br /> 3.1.1. Tính thích hợp của hệ thống đã mô tả đối với các dung dịch chuẩn có<br /> Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch nồng độ từ 13,5-270µg/ml, kết quả thu được<br /> chuẩn có nồng độ 135 µg/ml với điều kiện đã thể hiện trong bảng 4.<br /> chọn. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ<br /> thống được trình bày ở bảng 3. Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của<br /> bacoside A3<br /> Kết quả độ lệch chuẩn tương đối về thời<br /> Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic<br /> gian lưu và diện tích pic tương ứng là 0,1497<br /> 13,5 51351<br /> và 0,2015%, đều thấp hơn 2%. Điều đó cho 27,0 103830<br /> thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ 67,5 258925<br /> 135 522013<br /> thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù 216 821108<br /> hợp cho phép phân tích bacoside trong rau 270 1034329<br /> đắng biển.<br /> Bảng 3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ<br /> thống sắc ký<br /> STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic<br /> 1 20,302 523533<br /> 2 20,323 524442<br /> 3 20,323 524916<br /> 4 20,332 524622<br /> 5 20,354 524091<br /> 6 20,389 522013<br /> TB 20,337 523936,2<br /> SD 0,03045 1055,594 Hình 2. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của<br /> RSD (%) 0,1497 0,2015 bacoside A3<br /> <br /> <br /> 90  Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017<br />  KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương này đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng<br /> quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng 98-102% và độ lệch chuẩn tương đối