Bài giảng Phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm (Phần 4): Chương 4 - Hồ Phú Hà, Vũ Thu Trang

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:43

Thêm vào BST

Báo xấu

8
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm (Phần 4): Chương 4 - Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật" trình bày các nội dung chính sau: Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh; Các phương pháp kiểm định vi sinh vật trong thực phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo bài giảng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm (Phần 4): Chương 4 - Hồ Phú Hà, Vũ Thu Trang

Chương IV : Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật 4.1. Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh 4.1.1. Phương pháp lấy mẫu 4.1.2. Vận chuyển và bảo quản mẫu 4.1.3. Xử lý mẫu phân tích 4.2. Các phương pháp kiểm định vi sinh vật trong thực phẩm 4.2.1. Các phương pháp truyền thống 4.2.2. Các phương pháp xác định nhanh và tự động hóa 1 1 Pha loãng mẫu • Các dung dịch pha loãng • Tại sao không dùng nước cất? 2 1
Một số dung dịch pha loãng đặc biệt • Dung dịch Natri citrat (dùng cho phomat, phomat chế biến, sữa sấy màng) – Na3C6H5O7.2H2O 20 g/L • Dung dịch dikali hidro phosphat 20g/L – pH7,5: caseinat, phomat, phomat chế biến, váng sữa chua – pH8,5: casein axit, casein lactic 3 Một số phương pháp định lượng vi sinh vật 4 2
Đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 5 Phương pháp đếm số xác suất lớn nhất (MPN) Nguyên tắc: • Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và có khả năng thể hiện các đặc tính lên men (đục, đổi màu, sinh khí, mùi…) • Pha loãng mẫu liên tiếp theo bội số của 10 cho tới khi kết quả âm tính • Mỗi độ pha loãng cần nuôi cấy 3 ống lặp lại ở điều kiện thích hợp • Kiểm tra vi sinh vật có phát triển hay không, tính số ống có kq (+) • Xử lý số liệu theo bảng Mac Grady, và từ đó tính ra số lượng VSV 6 3
Phương pháp MPN Chuẩn bị và pha loãng mẫu Cấy mẫu vào trong ống nghiệm chứa môi trường (mỗi độ pha loãng 3 ống) Nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp Đọc kết quả, xác định số đặc trưng, tra bảng Mc Grady, tính kết quả 7 Phương pháp MPN 8 4
Chọn số đặc trưng 9 10 5
Tính số tế bào 11 Phương pháp đếm khuẩn lạc 12 6
Phương pháp đếm khuẩn lạc 13 • Đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) là gì? 14 7
15 Tính số lượng vi sinh vật • Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa (30-300). • Tính tổng số VSV theo công thức : • ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa • n1 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 • n2 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 • f1 - Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1 • v - thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp petri 16 8
Báo cáo kết quả • Theo TCVN 6264:1997: – Giữ lại đĩa có số khuẩn lạc từ 10-300 – Tính số khuẩn lạc theo công thức – Nếu tất cả đều ít hơn 10 khuẩn lạc? – Nếu tất cả đều nhiều hơn 300 khuẩn lạc? – Đơn vị của N? 17 • Giả sử độ pha loãng 10-3 đếmđược 168 và 215 khuẩn lạc; độ pha loãng 10-4 đếm được 14 và 25 khuẩnlạc → tính số cfu trong 1 ml mẫu ban đầu? • 1,92 x 10^5 cfu/ml • Giả sử ở độ pha loãng 10-1 hút thiếu 0,1 ml → tính sự chênh lệch kết quả? • 1% 18 9
1. Định lượng tổng số vi sinh vật • Tổng số VSV = VSV tồn tại và phát triển được trên môi trường dinh dưỡng chung, ở 300C, 24 - 72 giờ. • Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm có trong SPTP để đánh giá mức độ nhiễm tạp, tinh trạng vệ sinh, điều kiện bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của ẩn phẩm Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc 1. Nguyên tắc: - Nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng, 3010C, hiếu khí, 48–72 giờ - Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ số lượng tế bào sống có trong mẫu phân tích. 19 19 VSV tổng số Quy trinh ph©n tÝch VSV tổng số Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu TGA (Trypton Glucoza Agar) •Nuôi cấy trên / trong môi trường thạch Trypton(pepton) 5 g; (30oC, 24-72 h).  Glucoza 4 g;  Cao nÊm men 2,5 g; 1 lit  Th¹ch 15 g; Quan s¸t vµ ®ếm khuẩn lạc  Số KL : 30-300 N (khuÈn l¹c/g, ml) = C (n 1 + 0,1n 2 ).f 1 .v 20 20 10
Khuẩn lạc vi sinh vật tổng số hiếu khí ưa ấm 21 21 2. Định lượng tổng số nấm men-nấm mốc Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc 1. Nguyên tắc: Môi trường chứa chất ức chế vi khuẩn (Oxytetracyclin hoặc Chloramphenicol, (Yeast Glucose Chloramphenicol - YGC) - Nuôi cấy 301oC, hiếu khí, thời gian 48 - 72 giờ. - Đếm số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ tổng số nấm men-nấm mốc có trong mẫu phân tích. 22 22 11
2. Định lượng tổng số nấm men-nấm mốc Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (Yeast Glucose chloramphenicol) Glucoza 20 g; •Nuôi cấy trên / trong môi trường thạch Cao nÊm men 5 (30oC, 24-72 h). Th¹ch 15 1 lit Chloramphenicol (0,1) (Tetracyclin, Oxytetracyclin) Quan s¸t vµ ®ếm khuẩn lạc N (khuÈn l¹c/g, ml) = C (n 1 + 0,1n 2 ).f 1 .v 23 23 Khuẩn lạc nấm men, nấm mốc 24 24 12
VSV g©y bÖnh vµ g©y ngé ®éc 3. Định lượng Coliforms và E.coli  2 phương pháp tiêu chuẩn: - Đếm khuẩn lạc - MPN Môi trường đặc hiệu : - Endo - BGBL (Brilliant Green Bile Lactose) - VRB (Violet Red Bile) - EC 25 25 Môi trường xác định Coliform và E.coli Môi trường Endo Pepton 10 g; lactoza 10 g; K2HPO4 2,5 g; sulfit natri 3,3 g; fucshin kiềm 0,3 g; thạch 15 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH =7,5 Nguyên tắc Natri sulfit và fucshin = phức chất fuchsin-sulfit coliform lên men đường lactoza tạo thành aldehyt và axit, Aldehyt tác động đến phức chất fuchsin-sulfit và giải phóng fuchsin, Fuchsin tự do nhuộm khuẩn lạc thành màu hồng đến màu đỏ cánh sen, có thể có ánh kim hoặc không. 26 26 13
Môi trường xác định Coliform vµ E.coli Môi trường BGBL Pepton 10; lactoza 10; mật bò 20; Brilliant green 0,0133; H2O cho đủ 1000 ml; pH =7,2 Môi trường VRB Pepton 10; lactoza 5; NaCl 5; muối mật 1,5; tinh thể tím 0,002; Đá trung tính 0,03; thạch 15 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH =7,5 Môi trường EC Tryptose 20 g; lactoza 5 g; muối mật No3 1,5 g; K2HPO4 4 g : KH2PO4 1,5g; NaCl 5 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH =7 27 27 Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường đặc hiệu •Khuẩn lạc mầu hồng đến mầu đỏ đậm •d >0,5 mm •Môi trường Endo 28 •Môi trường VRB 28 14
Quy trinh định lượng Coliform vµ E.coli = MPN Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3) CÊy mt tăng sinh -TLS (37oC, 48 h, 9 èng). Khí → ống (+) Coliforms chịunhiÖt CÊy mt EC Coliforms CÊy mt kh¼ng ®Þnh (42-44oC, 48 h). phân BGBLB (37oC, 48 h) ống (+) ống (+) CÊy dd Trypton (42-44oC, 48 h).  Thử nghiệm Indol Coliforms Thö nghiÖm E.coli 29 IMVCi 29 VSV g©y bÖnh E. coli PhÐp thö kh¼ng ®Þnh IMViC I= Thử nghiệm sinh Indol (+) M= Thử nghiệm MR (Methyl Red) (+) V= Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (-) iC= Thử nghiệm Citrat (-) 30 30 15
Quy trinh định lượngColiform vµ E.coli = đếm KL Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3) CÊy mt VRB (37oC, 48 h, 9 èng). Đếm KL mầu Coliforms đỏ, chọn 5KL chịu nhiÖt CÊy EC lỏng Coliforms CÊy vào BGBL lỏng (44oC, 24-48 h). phân (37oC, 24-48 h) ống (+) ống (+) CÊy dd Trypton (42-44oC, 48 h).  Thử nghiệm Indol Coliforms Thö nghiÖm E.coli 31 IMVCi 31 VSV g©y bÖnh E. coli Quy trinh ph©n tÝch E.coli Ph¬ng ph¸p ®Õm khuÈn l¹c Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu CÊy trªn m«i trêng th¹ch (42-44oC, 24-48 h). M«i trêng Endo Nu«i cÊy trong nước Trypton ( 42oC, 48 h). I :Indol; M: methyl Vi : Thử nghiệm IMViC Tính tỷ lệ khẳng định E.coli C .R 32 (n 1 + 0,1n 2 ).f1 .v 32 16
VSV g©y bÖnh E. coli PhÐp thö kh¼ng ®Þnh IMViC a. Thử nghiệm sinh Indol (+) b. Thử nghiệm MR (Methyl Red) (+) c. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (-) d. Thử nghiệm Citrat (-) 33 33 a. Thử nghiệm sinh Indol Thử nghiệm sinh Indol (I) (+) tryptophanaza Tryptophan Indol + DMABA p-DMABA quinon (mÇu ®á) 1. MÉu đối chứng 2. Phản ứng (+) E.coli DMABA : 4-DiMethylAminoBenzAldehyt ➔Phân biệt E.coli (+) với các loại coliform khác (-) 34 34 17
Chủng E.coli NC10 35 35 Hình ảnh test indol của khuẩn lạc E. coli NC10 36 36 18
Phép thử khẳng định E. coli trong rau cải muối chua (-) Mẫu không sinh Indol (+) Mẫu sinh Indol. (-) (+) 37 37 b.Thử nghiệm Methyl Red Thử nghiệm Methyl Red (MR) (+) - (+) có mầu đỏ (hồng) khi pH6 KhuÈn l¹c nghi ngê ➔mt Glucoza Photphat ➔ 37oC, 2-5 ngày ➔ + thuốc thử MR 1. M©ò đối chứng 2. Phản ứng (+) E.coli ➔Phân biệt E.coli (+) với các loại coliform khác (-) 38 38 19
c. Thö nghiÖm VP (Voges-Prouskauer) Nguyên tắc : Glucoza Axit pyruvic Hỗn hợp axit (formic, axetic, 2,3-butanediol succinic, ethanol, CO2…) (O2, OH-) Thuốc thử (O2, OH, Axetoin -naphthol, guanidin) -naphthol Không đổi mầu ➔ (-) Diaxetyl guanidin E.coli (-) Diaxetyl-guanidin Mầu đỏ ➔ (+) Klebsiella, Enterobacter 39 39 Thö nghiÖm VP Cách tiến hành : •- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa 0,2 ml môi trường VP. Nuôi 37oC, 24 h. -Cho 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt 1-naphton pha trong cồn và sau đó cho 2 giọt dung dịch KOH, lắc đều - Phản ứng (+) khi xuất hiện mầu hồng đến mầu đỏ tươi trong vòng 15 phút. •Môi trường VP •Pepton 7g; glucoza 5 ; K2HPO4 5; H2O cho đủ 1l; pH =6,9 40 40 20