zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Bài thực hành phân tích vi sinh thực phẩm : Định tính Salmonella

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Báo xấu

1.283
lượt xem 131
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài thực hành phân tích vi sinh thực phẩm : Định tính Salmonella

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 3. Định tính Salmonella 3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Hình 12: Salmonella trên thạch XLD Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella. 3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ ở 420C, 18-24 giờ Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 370C, 24 giờ Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: - Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không - Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol (+); Sorbitol (+) Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 14 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 3.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú 1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 20ml Pepton: 10g BPW cất BPW trước khi khử trùng. (Buffered Pepton NaCl : 5g (buổi 2) Water) Na2HPO4: 3.5g pH 7.2 ± 0.2 KH2PO4: 1.5g Phân phối 30ml RV cho mỗi Môi trường cơ bản 1110 ml RV (Rappaport- tổ (10ml/ống nghiệm) trước Tryptone:5g pH 5.5 ± 0.2 Vassiliadis Soya khi khử trùng. (buổi 2) NaCl: 8g Pepton) KH2PO4: 1.6g Nước cất: 1000 ml Dung dịch MgCl2 MgCl2.6H2O: 400g Nước cất: 1000 ml Dung dịch Malachite green oxalate Malachite green oxalate: 0.4g Nước cất: 100 ml Môi trường hoàn chỉnh Môi trường cơ bản: 1000ml Dung dịch MgCl2: 100ml Dung dịch Malachite green oxalate: 10ml Cao nấm men: 3g 1000 ml nước Phân phối 50ml XLD cho XLD cất mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3) (Xylose Lysine L-lysine: 5g Desoxycholate) Xylose: 3.75g pH 7.4 ± 0.2 Đun sôi môi Lactose: 7.5g trường. Sucrose: 7.5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 15 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM hấp. Sodium deoxycholate: Không giữ 2.5g Không Ferric ammonium quá 1 ngày citrate: 0.8g Sodium thiosulfate: 6.8g NaCl: 5g Agar:15g Phenol red: 0.08g 1000 ml nước Phân phối 50ml HE cho mỗi Proteose Peptone: 12.0g HE cất tổ (25ml/petri) (buổi 3) (Hektoen Entric Yeast Extract: 3.0g Agar) Bile Salts No. 3: 9.0g pH 7.5± 0.2 Đun sôi môi Lactose: 12.0g trường. Saccharose: 12.0g Không hấp. Salicin: 2.0g Sodium Chloride: 5.0g Sodium Thiosulfate: 5.0g Ferric Ammonium Citrate : 1.5g Agar: 14.0g Bromthymol Blue: 65.0mg Acid Fuchsin : 0.1g 1000 ml nước Phân phối 50ml TSA cho Trypticase peptone: 15g TSA cất mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 4) (Tryptone Soya Phytone peptone: 5g Agar) NaCl: 5g pH 7.3± 0.2 Agar: 15g 1000 ml nước Phân phối 20ml KIA cho Polypeptone peptone: KIA cất mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) (Kliger Iron 20g (buổi 5) Agar) Lactose: 20g pH 7.4± 0.2 Dextrose: 1g NaCl: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 16 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Ferric ammonium citrate: 0.5g Sodium thiosulfate: 0.5g Agar: 15g Phenol red: 0.025g 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân Both Môi trường 1: MR-VP cất. phối 10ml/ống nghiệm. (Glucose Buffered peptone-water Kiểm tra lại môi trường cung Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 cấp nào để pha môi trường. Glucose: 5g (buổi 5) K2HPO4: 5g Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân Dipotassium Phosphate: RSU cất. phối 3ml/ống nghiệm. (Rustigian-Stuart 9.5g (buổi 5) Urea Broth) Yeast Extract: 0.1g pH 6.8 ± 0.2 Urea: 20g Monopotassium Phosphate: 9.1g Phenol Red: 0.01g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 17 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 4: Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô, các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK). Bước 5: Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm 420C. Ủ ở 420C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Bước 6: Phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau: + Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên XLD Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên HE + Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Bước 7: Khẳng định Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau: Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 18 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM + Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S. Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ. Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm. Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không có VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh và sinh H2S. + Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48 giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea màu vàng cam. + Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn Hình 17: kết quả thử Biên soạn:m VPThùy nghiệ Lê Page | 19 Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường. Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 50C – 500C, tối ưu ở 350C – 400C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn. 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng nhất bằng Stomacher, độ pha loãng 10-1 Pha loãng đến các độ pha loãng 10-2, 10-3 Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ ở 300C, 24 giờ Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc) cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 300C, 24 giờ Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên men glucose, thử nghiệm VP. Kết luận B. cereus Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.