TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015<br />
<br />
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO VÀ<br />
TÍNH KÍCH ỨNG DA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br />
CỦA DUNG DỊCH MAFENID ACETAT<br />
Lương Quang Anh*; Nguyễn Như Lâm*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da của dung dịch mafenid<br />
acetate (MA) trên các chủng vi khuẩn (VK) thƣờng gặp trong bỏng trên thỏ thực nghiệm .<br />
Phương pháp: sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn<br />
in vitro. 6 thỏ khỏe mạnh đƣợc đắp thuốc trên da lƣng và theo dõi điểm kích ứng da sau 72 giờ<br />
tiếp xúc. Kết quả: thuốc có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella flexneri, Salmonella typhi,<br />
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus<br />
cereus, Sarcina lutea. Đồng thời, thuốc cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Pseudomonas<br />
aeruginosa phân lập đƣợc tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia. Tuy nhiên, VK vẫn<br />
phát triển mạnh khi tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5%. Điểm kích ứng bằng 0 khi đắp<br />
thuốc trên lƣng của thỏ thí nghiệm. Kết luận: dung dịch MA 5% có tác dụng kháng khuẩn tốt với<br />
nhiều chủng VK, trong đó có trực khuẩn mủ xanh phân lập đƣợc tại Viện Bỏng Quốc gia và<br />
không kích ứng khi sử dụng trên thỏ.<br />
* Từ khóa: Mafenid acetat; Tác dụng kháng khuẩn; Kích ứng da.<br />
<br />
Evaluation of Antibacterial Activities In Vitro and Skin Irritation of<br />
Mafenide Acetate Solution on Rabbits<br />
Summary<br />
Objectives: Evaluation of antibacterial activities in vitro and skin irritation of mafenide acetate<br />
(MA) solution on rabbits. Methods: Determination of antibacterial activities in vitro by the agar<br />
well diffusion method. Assessment of skin irritation grade on 6 healthy rabbits that were topically<br />
applied the drug on its back after 72 hours of contact. Results: The drug had effectiveness on<br />
Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus<br />
pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea. With regard to Pseudomonas aeruginosa<br />
isolated from samples obtained at Intensive Care Unit, MA solution showed its germicide similarly.<br />
Conversely, the baterium kept with its powerful growth when the drug at doses below 5% was<br />
applied on. The skin irritation grade was at zero. Conclusions: The drug showed good antimicrobial<br />
activities on some bacteria species including Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital.<br />
It had no skin irritation when applied on experimental rabbits.<br />
* Key words: Mafenide acetate; Antibacterial activities; Skin irritation.<br />
* Viện Bỏng Qu c gia<br />
** Học viện Quân y<br />
Người phản hồi (Corresponding): Lương Quang Anh (luongquanganh@vmmu.edu.vn)<br />
Ngày nhận bài: 27/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/09/2015<br />
Ngày bài báo được đăng: 18/09/2015<br />
<br />
17<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Tại Việt Nam, nhiễm khuẩn trong bỏng<br />
đang trở thành vấn đề lớn, ảnh hƣởng<br />
trực tiếp đến chất lƣợng điều trị bệnh<br />
nhân (BN), nhất là trong tình trạng còn<br />
thiếu các thuốc kháng khuẩn tại chỗ thực<br />
sự có hiệu quả. Trong đó, trực khuẩn mủ<br />
xanh là VK Gram âm hàng đầu gây nhiễm<br />
khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở các BN bỏng.<br />
Điều trị vết thƣơng, vết bỏng nhiễm trực<br />
khuẩn mủ xanh rất khó khăn vì VK này có<br />
khả năng đề kháng cao đối với hầu hết<br />
các thuốc kháng sinh, đặc biệt là các<br />
chủng đa kháng kháng sinh, làm tăng chi<br />
phí điều trị cũng nhƣ làm tăng tỷ lệ tử<br />
vong ở BN bỏng [1, 2, 3].<br />
MA là thuốc thuộc nhóm sulfamid đã<br />
đƣợc sử dụng ở các trung tâm điều trị<br />
bỏng trên thế giới. Đây là thuốc có độ an<br />
toàn cao, hiệu quả diệt khuẩn tốt, trong<br />
đó có trực khuẩn mủ xanh. MA chủ yếu<br />
sử dụng dƣới dạng dung dịch và dạng<br />
kem, dùng đơn lẻ hoặc kết hợp với một<br />
thuốc kháng khuẩn khác. Viện Bỏng Quốc<br />
gia đã bào chế thành công dung dịch MA<br />
5% đạt tiêu chuẩn cơ sở. Vì vậy, nghiên<br />
cứu này đƣợc thực hiện nhằm: Bước đầu<br />
đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro và<br />
tính ích ứng da của chế phẩm, làm cơ<br />
sở hoa học cho việc ứng dụng chế phẩm<br />
này trong điều trị BN bỏng.<br />
NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG VÀ<br />
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Nguyên vật liệu và đối tƣợng<br />
nghiên cứu.<br />
* Nguyên vật liệu:<br />
- Dung dịch MA 5% do Viện Bỏng Quốc<br />
gia sản xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở.<br />
18<br />
<br />
- Thuốc đối chiếu: streptomycin sulfat<br />
16 IU/ml đối với thử kháng khuẩn VK<br />
Gram (-), benzathin penicillin 20 IU/ml đối<br />
với thử kháng khuẩn VK Gram (+). Môi<br />
trƣờng canh thang nuôi cấy vi sinh vật<br />
gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt<br />
0,3%, nƣớc vừa đủ 100 ml. Môi trƣờng<br />
thạch thƣờng gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%,<br />
cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nƣớc vừa đủ<br />
100 ml.<br />
* Đ i tượng nghiên cứu:<br />
- Chủng vi sinh vật kiểm định do Bộ<br />
môn Vi sinh - Sinh học, Đại học Dƣợc<br />
Hà Nội cung cấp, bao gồm: VK Gram (-):<br />
Escherichia coli (EC), Proteus mirabilis (Pro),<br />
Shigella flexneri (Shi), Salmonella typhi<br />
(Sal), Pseudomonas aeruginosa (Pseu).<br />
VK gram (+): Staphylococcus aureus (SA),<br />
Bacillus pumilus (BP), Bacillus subtilis (BS),<br />
Bacillus cereus (BC), Sarcina lutea (Sar).<br />
- Phân lập chủng trực khuẩn mủ xanh<br />
từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Hồi sức Cấp<br />
cứu, Viện Bỏng Quốc gia. 6 thỏ đực khỏe<br />
mạnh, cân nặng 2.000 ± 100 g, đạt tiêu<br />
chuẩn thí nghiệm.<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Phương pháp đánh giá tác dụng háng<br />
huẩn in vitro:<br />
- Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm<br />
bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch<br />
đối với một số chủng VK quốc tế.<br />
+ Tiến hành: các khoanh giấy lọc vô<br />
trùng đƣợc tẩm 3 lần với dung dịch mẫu<br />
thử, sấy ở nhiệt độ < 60oC đến khô hết<br />
dung môi. Cấy vi sinh vật kiểm định vào<br />
môi trƣờng canh thang, nuôi cấy cho phát<br />
triển trong tủ ấm 37oC từ 18 - 24 giờ đến<br />
nồng độ 107 tế bào/ml. Môi trƣờng thạch<br />
thƣờng vô trùng (làm lạnh về 45 - 500C)<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015<br />
<br />
đƣợc cấy vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ<br />
2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để vi sinh vật<br />
phân tán đều trong môi trƣờng thạch<br />
thƣờng, đổ vào đĩa petri vô trùng với thể<br />
tích 20 ml/đĩa, để thạch đông lại. Khoanh<br />
giấy lọc đã tẩm chất thử đặt lên bề mặt<br />
môi trƣờng thạch thƣờng chứa vi sinh vật<br />
theo sơ đồ định sẵn. Ủ các đĩa petri có<br />
mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC<br />
trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả, đo đƣờng<br />
kính vòng vô khuẩn bằng thƣớc kẹp<br />
Panmer có độ chính xác 0,02 mm.<br />
+ Đánh giá kết quả: dựa vào đƣờng<br />
kính vòng vô khuẩn và đánh giá theo công<br />
thức sau:<br />
n<br />
<br />
D<br />
D=<br />
<br />
<br />
i 1<br />
<br />
n<br />
<br />
<br />
<br />
n<br />
<br />
i<br />
<br />
SD = ( D D)<br />
i 1<br />
<br />
2<br />
<br />
i<br />
<br />
n 1<br />
<br />
<br />
<br />
D : Đƣờng kính trung bình vòng vô<br />
khuẩn, Di: Đƣờng kính vòng vô khuẩn.<br />
SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu<br />
chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song.<br />
- Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm<br />
bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch<br />
đối với Pseudomonas aeruginosa phân<br />
lập tại Viện Bỏng Quốc gia.<br />
* Tiến hành: tạo một lỗ có đƣờng kính<br />
10 mm trên bề mặt đĩa thạch. Đổ dung<br />
dịch thử vào lấp đầy lỗ trên bề mặt môi<br />
trƣờng thạch thƣờng chứa Pseudomonas<br />
aeruginosa đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm<br />
tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng<br />
Quốc gia theo sơ đồ định sẵn. Ủ các đĩa<br />
petri có mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ<br />
37oC trong 24 giờ. Sau đó, lấy các đĩa petri<br />
ra đọc kết quả. Đo đƣờng kính vòng vô<br />
khuẩn bằng thƣớc chia độ tính bằng mm.<br />
<br />
- Xác định sơ bộ sự phát triển của<br />
Pseudomonas aeruginosa phân lập tại<br />
Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc<br />
ở các nồng độ khác nhau.<br />
Từ dung dịch MA 5%, tiến hành pha<br />
các dung dịch MA có nồng độ giảm dần<br />
tƣơng ứng với nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16<br />
và 1/32 so với nồng độ MA 5%. Hút chính<br />
xác 1 ml dung dịch này cho vào ống nghiệm<br />
chứa 100 µl hỗn dịch chứa 108 VK/ml.<br />
Cấy hỗn dịch VK và thuốc vào các đĩa<br />
petri thạch thƣờng, để trong tủ ấm ở nhiệt<br />
độ 370C trong 24 giờ. Sau đó, lấy các đĩa<br />
petri ra để theo dõi sự phát triển của VK<br />
trên các đĩa thạch tƣơng ứng với VK tiếp<br />
xúc với thuốc ở nồng độ khác nhau.<br />
* Phương pháp đánh giá tính ích ứng<br />
da trên thỏ thực nghiệm:<br />
- Thử nghiệm tiến hành trên 6 thỏ.<br />
Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lƣng đã<br />
cạo, đắp thuốc thử dạng dung dịch. Bên<br />
phải đặt thuốc thử nghiệm, bên trái đặt<br />
dung dịch natri clorid 0,9%. Nhúng đều<br />
lƣợng thuốc thử vào gạc đã tiệt trùng có<br />
diện tích 2,5 x 2,5 cm. Áp gạc có thuốc<br />
thử vào vùng da định thử (đã cạo sạch<br />
lông). Cố định miếng gạc trong 4 giờ để<br />
đảm bảo miếng gạc luôn áp vào da thỏ.<br />
Sau 4 giờ, bóc gạc, rửa sạch vùng da<br />
bằng nƣớc cất. Nhận định kết quả sau 4,<br />
24, 48, 72 giờ đắp thuốc.<br />
Đánh giá phản ứng trên chỗ da đặt<br />
thuốc xem mức độ kích ứng gây ban đỏ<br />
hoặc phù theo thang điểm đƣợc quy định<br />
sẵn nhƣ sau:<br />
- Đánh giá phản ứng của da ở trạng<br />
thái gây ban đỏ, có vẩy xƣớc (A).<br />
Không có ban đỏ: 0 điểm; ban đỏ rất nhẹ:<br />
1 điểm; ban đỏ nhận thấy rõ: 2 điểm; ban đỏ<br />
19<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015<br />
<br />
vừa phải đến nghiêm trọng: 3 điểm; ban<br />
đỏ có vẩy xƣớc nhẹ: 4 điểm.<br />
<br />
3 điểm; phù nề nghiêm trọng (viền phồng<br />
≥ 1 mm): 4 điểm.<br />
<br />
- Đánh giá phản ứng của da ở trạng<br />
thái phù nề (B).<br />
<br />
- Đánh giá kết quả: lấy trung bình của<br />
2 điểm A và B là điểm kích ứng da của<br />
chế phẩm. Chế phẩm đạt yêu cầu về<br />
độ kích ứng da có điểm kích ứng da<br />
bằng 0.<br />
<br />
Không phù nề: 0 điểm; phù nề nhẹ:<br />
1 điểm; phù nề nhẹ có viền phồng:<br />
2 điểm; phù nề vừa phải có viền phồng:<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br />
1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro.<br />
* Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên các chủng VK qu c tế:<br />
Tiến hành đo vòng vô khuẩn khi cho thuốc tiếp xúc với các chủng VK quốc tế.<br />
Bảng 1: Kết quả đo vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên các chủng VK.<br />
VI SINH VẬT<br />
<br />
MẪU<br />
<br />
D ˉ(mm)<br />
<br />
s<br />
<br />
VI SINH VẬT<br />
<br />
MẪU<br />
<br />
D ˉ(mm)<br />
<br />
s<br />
<br />
Pseu<br />
<br />
2<br />
<br />
11,02<br />
<br />
0,03<br />
<br />
SA<br />
<br />
2<br />
<br />
10,37<br />
<br />
0,65<br />
<br />
3<br />
<br />
9,29<br />
<br />
0,21<br />
<br />
3<br />
<br />
10,91<br />
<br />
0,28<br />
<br />
4<br />
<br />
3,02<br />
<br />
0,12<br />
<br />
4<br />
<br />
10,00<br />
<br />
0,41<br />
<br />
5<br />
<br />
0,00<br />
<br />
0,00<br />
<br />
5<br />
<br />
0,00<br />
<br />
0,00<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
10,29<br />
<br />
0,24<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
15,51<br />
<br />
0,37<br />
<br />
2<br />
<br />
11,53<br />
<br />
0,38<br />
<br />
2<br />
<br />
17,04<br />
<br />
0,54<br />
<br />
3<br />
<br />
KK<br />
<br />
3<br />
<br />
18,72<br />
<br />
0,72<br />
<br />
4<br />
<br />
KK<br />
<br />
4<br />
<br />
21,27<br />
<br />
0,52<br />
<br />
5<br />
<br />
KK<br />
<br />
5<br />
<br />
18,83<br />
<br />
0,31<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
KK<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
23,70<br />
<br />
0,42<br />
<br />
2<br />
<br />
14,07<br />
<br />
0,21<br />
<br />
2<br />
<br />
13,03<br />
<br />
0,05<br />
<br />
3<br />
<br />
11,19<br />
<br />
0,80<br />
<br />
3<br />
<br />
13,87<br />
<br />
0,33<br />
<br />
4<br />
<br />
10,63<br />
<br />
0,26<br />
<br />
4<br />
<br />
3,15<br />
<br />
0,26<br />
<br />
5<br />
<br />
8,03<br />
<br />
0,05<br />
<br />
5<br />
<br />
11,27<br />
<br />
0,19<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
10,43<br />
<br />
0,49<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
17,00<br />
<br />
0,14<br />
<br />
2<br />
<br />
8,97<br />
<br />
0,53<br />
<br />
2<br />
<br />
14,39<br />
<br />
0,29<br />
<br />
3<br />
<br />
8,80<br />
<br />
0,51<br />
<br />
3<br />
<br />
16,43<br />
<br />
0,42<br />
<br />
4<br />
<br />
8,54<br />
<br />
0,04<br />
<br />
4<br />
<br />
14,20<br />
<br />
0,86<br />
<br />
5<br />
<br />
8,13<br />
<br />
0,10<br />
<br />
5<br />
<br />
9,33<br />
<br />
0,24<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
12,53<br />
<br />
0,23<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
25,57<br />
<br />
0,45<br />
<br />
Pro<br />
<br />
Shi<br />
<br />
Sal<br />
<br />
20<br />
<br />
BS<br />
<br />
BP<br />
<br />
Sar<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015<br />
EC<br />
<br />
2<br />
<br />
KK<br />
<br />
3<br />
<br />
BC<br />
<br />
2<br />
<br />
10,57<br />
<br />
0,46<br />
<br />
KK<br />
<br />
3<br />
<br />
8,30<br />
<br />
0,20<br />
<br />
4<br />
<br />
KK<br />
<br />
4<br />
<br />
11,13<br />
<br />
0,09<br />
<br />
5<br />
<br />
KK<br />
<br />
5<br />
<br />
0,00<br />
<br />
0,00<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
17,00<br />
<br />
Chuẩn<br />
<br />
21,83<br />
<br />
0,85<br />
<br />
0,82<br />
<br />
(Ghi chú: KK: kìm khuẩn).<br />
Dung dịch bào chế có tác dụng trên nhiều chủng VK nhƣ: Shigella flexneri, Salmonella<br />
typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus<br />
subtilis, Bacillus cereus và Sarcina lutea. Trong đó, đáng chú ý là thuốc đều có tác dụng<br />
kháng VK Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. Đây là 2 chủng VK<br />
hay gặp trên vết bỏng. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về MA [4, 6]. Ngoài<br />
ra, thuốc chỉ có tác dụng kìm khuẩn đối với VK Escherichia coli, Proteus mirabilis.<br />
<br />
Hình 1a: Vòng vô khuẩn trên<br />
Pseudomonas aeruginos.<br />
<br />
Hình 1b: Vòng vô khuẩn trên<br />
Staphylococcus aureus.<br />
<br />
Hình 1: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên một số chủng VK<br />
(Ghi chú: Mẫu chuẩn: Ở vị trí điểm 0 giờ.<br />
Mẫu 2, 3, 4 (từ trái qua phải tính từ mẫu chuẩn): mẫu thử dung dịch MA).<br />
* Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn<br />
trên chủng VK phân lập được tại bệnh viện:<br />
Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên<br />
chủng VK phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia:<br />
Lấy mẫu bệnh phẩm từ Khoa Hồi sức<br />
Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia và phân lập<br />
Pseudomonas aeruginosa. Đây là chủng<br />
VK bệnh viện, có khả năng đề kháng cao<br />
với thuốc kháng khuẩn.<br />
* Giá trị vòng vô khuẩn của dung dịch<br />
MA trên Pseudomonas aeruginosa phân<br />
lập tại Viện Bỏng Qu c gia:<br />
<br />
Mẫu 1: 5,0 mm; mẫu 2: 7,0 mm; mẫu 3:<br />
7,0 mm.<br />
Nhƣ vậy, dung dịch MA có tác dụng<br />
kháng khuẩn đối với Pseudomonas<br />
aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc<br />
gia. Đáng chú ý, đây là chủng VK gặp tại<br />
khoa Hồi sức Cấp cứu, vì vậy có thể sử<br />
dụng chế phẩm này trong điều trị BN<br />
bỏng nặng với mục đích dự phòng nhiễm<br />
trực khuẩn mủ xanh.<br />
21<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
