Nghiên cứu tác dụng dự phòng và điều trị của hỗn hợp 2 kháng thể kháng vi khuẩn và kháng độc tố tả trên động vật thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ CỦA HỖN HỢP<br /> 2 KHÁNG THỂ KHÁNG VI KHUẨN VÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ<br /> TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br /> Nguyễn Hoàng Ngân*; Trịnh Thanh Hùng**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá tác dụng dự phòng và điều trị của hỗn hợp 2 kháng thể kháng vi khuẩn<br /> (VK) và kháng độc tố tả trên động vật thực nghiệm gây nhiễm VK tả. Đối tượng và phương pháp:<br /> sử dụng mô hình chuột nhắt trắng sơ sinh 4 ngày tuổi nhiễm VK tả theo phương pháp của<br /> Kazuyuki Hirai và CS (2010). So sánh tác dụng của hỗn hợp 2 kháng thể kháng VK và kháng độc<br /> tố tả với khi chỉ dùng kháng thể kháng độc tố tả hoặc kháng thể kháng VK tả. Kết quả:<br /> sự kết hợp kháng thể IgY kháng VK tả và kháng thể IgY kháng độc tố tả tạo nên tác dụng<br /> hiệp đồng. Tác dụng của hỗn hợp 2 kháng thể kháng VK và kháng độc tố tả tăng hơn so với chỉ<br /> sử dụng kháng thể IgY kháng VK tả hoặc kháng thể IgY kháng độc tố tả. Kết luận: hỗn hợp<br /> 2 kháng thể kháng VK và kháng độc tố tả sử dụng theo đường uống có tác dụng tốt trong<br /> điều trị và dự phòng đối với lây nhiễm VK tả khi thử nghiệm trên chuột nhắt trắng sơ sinh<br /> 4 ngày tuổi.<br /> * Từ khóa: Kháng thể; Vi khuẩn tả; Độc tố tả.<br /> <br /> Study of Prevention and Treatment Effect of the Mixture of Anti-V.<br /> Cholera and Anti-cholera Toxin Antibodies on Experimental Animals<br /> Summary<br /> Objective: To evaluate the prevention and treatment effect of the mixture of anti-V. cholera<br /> and anti-cholera toxin antibodies on experimental animals infected by cholera bacteria. Subjects<br /> and methods: Using 4-day-old newborn mice infected by cholera bacteria, follow the method<br /> described by Kazuyuki Hirai et al (2010). Effect of the mixture of anti-V. cholera and anti-cholera<br /> toxin antibodies was compared with the effect when only using anti-V. cholera antibody or anticholera toxin antibody. Results: The combination of the anti-V.cholera antibody and anti-cholera<br /> toxin antibody created synergistic effects. The effect of the mixture of anti-V. cholera and anticholera toxin antibodies was much larger than when only using anti-V. cholera IgY antibody or<br /> anti-cholera toxin IgY antibody. Conclusion: The mixture of anti-V. cholera and anti-cholera toxin<br /> antibodies orally use had good effect on the prevention and treatment of cholera infection when<br /> tested on mice 4-day-old newborn.<br /> * Key words: Antibody; V. cholera; Cholera toxin.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bé Khoa häc C«ng nghÖ<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hoàng Ngân(nguyenhoangngan@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 30/10/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 05/11/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 12/01/2016<br /> <br /> 16<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh tả do VK tả (Vibrio cholera) là một<br /> bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Cơ chế<br /> bệnh sinh của bệnh có sự tham gia của<br /> độc tố tả (cholera toxin), do VK tả tiết ra<br /> sau khi thâm nhập vào ruột bệnh nhân;<br /> độc tố gây tổn thương tế bào niêm mạc<br /> ruột, dẫn đến tăng tiết dịch tại ruột, gây ỉa<br /> chảy cấp, nếu không được điều trị kịp<br /> thời có thể dẫn đến tử vong do mất nước,<br /> điện giải. Sử dụng kháng thể kháng VK<br /> và độc tố tả để dự phòng và điều trị bệnh<br /> tả đã được thực hiện ở một số nước tiên<br /> tiến và cho hiệu quả tốt. Bộ môn Miễn<br /> dịch, Học viện Quân y kháng thể IgY<br /> kháng VK tả và kháng thể IgY kháng độc<br /> tố tả (thu được từ lòng đỏ trứng gà)<br /> nghiên cứu thành công, qua đánh giá<br /> bước đầu cho thấy có tác dụng bảo vệ<br /> đối với chuột nhắt trắng sơ sinh gây<br /> nhiễm VK tả. Sự kết hợp giữa 2 loại<br /> kháng thể này được kỳ vọng sẽ tạo nên<br /> tác dụng hiệp đồng trong dự phòng và<br /> điều trị lây nhiễm VK tả. Để có cơ sở<br /> khoa học về sự kết hợp này, chúng tôi<br /> tiến hành nghiên cứu: Tác dụng dự phòng<br /> và điều trị của hỗn hợp 2 kháng thể này<br /> trên động vật thực nghiệm gây nhiễm<br /> VK tả.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Chế phẩm nghiên cứu:<br /> - Kháng thể IgY đặc hiệu kháng VK tả<br /> (gọi tắt là IgY kháng VK tả) do Bộ môn<br /> Miễn dịch, Học viện Quân y cung cấp ở<br /> dạng bột đông khô, đạt tiêu chuẩn cơ sở.<br /> - Kháng thể IgY đặc hiệu kháng độc<br /> tố tả (gọi tắt là IgY kháng độc tố tả) do<br /> <br /> Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y cung<br /> cấp ở dạng bột đông khô, đạt tiêu chuẩn<br /> cơ sở.<br /> - Hỗn hợp 2 kháng thể trên theo tỷ lệ<br /> 1:1 (w/w).<br /> Hòa tan các chế phẩm thử trên trong<br /> nước cất thành dạng dung dịch (1 mg<br /> kháng thể/ml) cho chuột uống. Cho chuột<br /> uống bằng cách sử dụng bơm tiêm nhỏ<br /> (loại 1 ml) với kim luồn của trẻ em.<br /> Để tránh gây tổn thương cho chuột và<br /> hạn chế yếu tố gây nhiễu trong nghiên<br /> cứu, thao tác cho chuột uống do 1 người<br /> thực hiện đã được tập luyện thật thuần<br /> thục trước khi tiến hành thí nghiệm.<br /> * Động vật thí nghiệm:<br /> Chuột nhắt trắng sơ sinh dòng Swiss,<br /> 4 ngày tuổi, không phân biệt giống. Chuột<br /> sơ sinh do Ban Cung cấp Động vật thí<br /> nghiệm, Học viện Quân y cung cấp, được<br /> tách khỏi chuột mẹ trước khi tiến hành thí<br /> nghiệm 4 giờ.<br /> * Chủng VK tả gây bệnh thực nghiệm:<br /> Chủng VK tả 01 (Vibrio cholerae 01)<br /> do Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội<br /> cung cấp. Nuôi cấy chủng VK tả trong 12<br /> giờ ở 300 C trong 400 ml dung dịch nuôi<br /> dưỡng BHI (BHI broth), có lắc, rửa 2 lần<br /> với dung dịch nước muối sinh lý đệm<br /> phosphat (phosphat buffered saline PBS; pH 7,2; vô khuẩn), treo trong dung<br /> dịch PBS với nồng độ 7,5 x 108 CFU/ml<br /> ngay trước khi gây nhiễm VK tả cho chuột.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Đánh giá tác dụng dự phòng và điều trị<br /> nhiễm VK tả của hỗn hợp 2 kháng thể<br /> trên mô hình chuột nhắt trắng sơ sinh 4<br /> ngày tuổi nhiễm VK tả theo phương pháp<br /> Kazuyuki Hirai và CS (2010) [1].<br /> 17<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> * Nghiên cứu 1: đánh giá tác dụng điều trị của hỗn hợp 2 kháng thể, so sánh với IgY<br /> kháng VK tả và IgY kháng độc tố tả dùng đơn lẻ.<br /> Chuột nhắt trắng sơ sinh 4 ngày tuổi, tách khỏi chuột mẹ trước khi tiến hành thí<br /> nghiệm 4 giờ và chia làm 5 lô, mỗi lô 20 con.<br /> Bảng 1: Phân lô và cho chuột uống trong nghiên cứu 1.<br /> Lô chuột<br /> Thời gian<br /> 4 giờ sau khi tách<br /> khỏi mẹ (gây nhiễm)<br /> <br /> Lô 1<br /> Lô 2<br /> (chứng<br /> (chứng bệnh lý)<br /> sinh học)<br /> 50 µl<br /> PBS<br /> <br /> Lô 3<br /> (hỗn hợp 2<br /> kháng thể)<br /> <br /> Lô 4<br /> Lô 5 (IgY kháng<br /> độc tố tả)<br /> (IgY kháng VK tả)<br /> <br /> 50 µl<br /> 50 µl<br /> 50 µl<br /> 50 µl<br /> V. cholerae 01<br /> V. cholerae 01 V. cholerae 01<br /> V. cholerae 01<br /> 8<br /> 8<br /> 8<br /> 8<br /> 7,5 x 10 CFU/ml 7,5 x 10 CFU/ml 7,5 x 10 CFU/ml 7,5 x 10 CFU/ml<br /> <br /> 3 giờ sau gây nhiễm<br /> <br /> 50 µl<br /> PBS<br /> <br /> 50 µl<br /> PBS<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp 2<br /> kháng thể<br /> <br /> 50 µl<br /> kháng VK tả<br /> <br /> 50 µl<br /> kháng độc tố tả<br /> <br /> Cứ sau mỗi 4 giờ<br /> <br /> 50 µl<br /> PBS<br /> <br /> 50 µl<br /> PBS<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể<br /> <br /> 50 µl<br /> kháng VK tả<br /> <br /> 50 µl<br /> kháng độc tố tả<br /> <br /> Việc cho chuột uống ở các thời điểm cứ mỗi 4 giờ được thực hiện trên những chuột<br /> còn sống đến thời điểm đó, cho tới thời điểm 72 giờ kể từ khi bắt đầu thí nghiệm (cho<br /> lây nhiễm). Ghi nhận số lượng và thời điểm chuột chết trong từng lô trong vòng 72 giờ<br /> kể từ khi bắt đầu thí nghiệm.<br /> * Nghiên cứu 2: đánh giá ảnh hưởng của thời gian giữa các lần dùng thuốc lên tác<br /> dụng điều trị của hỗn hợp 2 kháng thể.<br /> Chuột nhắt trắng sơ sinh 4 ngày tuổi, tách khỏi chuột mẹ trước khi tiến hành thí<br /> nghiệm 4 giờ, chia làm 4 lô, mỗi lô 20 con.<br /> Bảng 2: Phân lô và cho chuột uống trong nghiên cứu 2.<br /> Lô chuột<br /> Thời gian<br /> <br /> Lô 1 (lô chứng)<br /> <br /> Lô 2 (cách 4 giờ)<br /> <br /> Lô 3 (cách 8 giờ)<br /> <br /> Lô 4 (cách 12 giờ)<br /> <br /> 50 µl<br /> V. cholerae 01<br /> 8<br /> 7,5 x 10 CFU/ml<br /> <br /> 50 µl V. cholerae 01<br /> 8<br /> 7,5 x 10 CFU/ml<br /> <br /> 50 µl V. cholerae 01<br /> 8<br /> 7,5 x 10 CFU/ml<br /> <br /> 50 µl PBS<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể<br /> <br /> 50 µl PBS 4 giờ<br /> 1 lần<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể 4 giờ<br /> 1 lần<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể, 8 giờ<br /> 1 lần, các lần khác<br /> uống 50 µl PBS<br /> <br /> 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể, 12 giờ<br /> 1 lần, các lần khác<br /> uống 50 µl PBS<br /> <br /> 4 giờ sau khi<br /> 50 µl V. cholerae 01<br /> tách khỏi mẹ<br /> 8<br /> 7,5 x 10 CFU/ml<br /> (gây nhiễm)<br /> 3 giờ sau<br /> gây nhiễm<br /> Các lần tiếp<br /> theo, cứ 4 giờ<br /> cho uống 1 lần<br /> <br /> Việc cho chuột uống ở các thời điểm, cứ sau mỗi 4 giờ thực hiện với những chuột<br /> còn sống đến thời điểm đó, cho tới thời điểm 72 giờ kể từ khi bắt đầu thí nghiệm (cho<br /> lây nhiễm). Ghi nhận số lượng và thời điểm chuột chết trong từng lô trong vòng 72 giờ<br /> kể từ khi bắt đầu thí nghiệm.<br /> 18<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> * Nghiên cứu 3: đánh giá tác dụng dự<br /> phòng của hỗn hợp 2 kháng thể:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Chuột nhắt trắng sơ sinh 4 ngày tuổi,<br /> tách khỏi chuột mẹ trước khi tiến hành thí<br /> nghiệm 4 giờ, và làm 5 lô, mỗi lô 20 con.<br /> <br /> 1. Kết quả nghiên cứu 1: tác dụng<br /> điều trị của hỗn hợp 2 kháng thể, so<br /> sánh với IgY kháng VK tả và IgY kháng<br /> độc tố tả dùng đơn lẻ.<br /> <br /> - Lô chứng sinh học: uống 50 µl PBS<br /> tại thời điểm sau tách mẹ 4 giờ. Sau đó<br /> cứ mỗi 4 giờ cho uống 50 µl PBS.<br /> - Lô chứng bệnh 1: uống 50 µl V. cholerae<br /> 01, 7,5 x 108 CFU/ml tại thời điểm sau<br /> tách mẹ 4 giờ. Sau đó cứ mỗi 4 giờ cho<br /> uống 50 µl PBS.<br /> - Lô dự phòng 1: uống 50 µl V. cholerae<br /> 01, 7,5 x 10 8 CFU/ml trộn lẫn hỗn hợp<br /> 2 kháng thể 1 mg/ml tại thời điểm sau tách<br /> mẹ 4 giờ. Sau đó cứ mỗi 4 giờ cho uống<br /> 50 µl PBS.<br /> - Lô chứng bệnh 2: uống 50 µl PBS tại<br /> thời điểm sau tách mẹ 4 giờ, sau 1 giờ<br /> uống 50 µl V. cholerae 7,5 x 108 CFU/ml.<br /> Sau đó cứ mỗi 4 giờ cho uống 50 µl PBS.<br /> - Lô dự phòng 2: uống 50 µl hỗn hợp<br /> 2 kháng thể tại thời điểm sau tách mẹ<br /> 4 giờ, sau 1 giờ uống 50 µl V. cholerae<br /> 7,5 x 108 CFU/ml. Sau đó cứ mỗi 4 giờ<br /> cho uống 50 µl PBS.<br /> Ghi nhận số lượng và thời điểm các<br /> chuột chết trong từng lô trong vòng 72 giờ<br /> kể từ khi bắt đầu cho lây nhiễm.<br /> <br /> - Chuột ở lô 1 không gây nhiễm VK tả,<br /> cho uống dung dịch PBS, sử dụng làm lô<br /> chứng sinh học nhằm đảm bảo việc thực<br /> hiện thao tác cho chuột uống qua sonde<br /> dạ dày không gây chết động vật thí nghiệm,<br /> do đó không gây nhiễu đối với kết quả<br /> nghiên cứu. Kết quả cho thấy trong nhóm<br /> này, 13/20 chuột (65 %) sống đến 72 giờ<br /> kể từ khi bắt đầu thí nghiệm. Phẫu tích<br /> chuột quan sát bên trong thấy các quai<br /> ruột bình thường, hậu môn sạch.<br /> - Chuột ở lô 2 được gây nhiễm VK tả<br /> (50 µl V. cholerae 01, 7,5 x 108 CFU/ml),<br /> cho uống dung dịch PBS, sử dụng làm lô<br /> chứng bệnh lý. Chuột ở lô này nhanh<br /> chóng bị chết trước 20 giờ kể từ khi gây<br /> nhiễm. Tính từ thời điểm gây nhiễm, thời<br /> gian sống thêm trung bình của chuột ở lô<br /> 2 là 14,12 giờ. Phẫu tích chuột quan sát<br /> bên trong thấy các quai ruột căng và đầy<br /> chất lỏng, hậu môn dính dịch phân (hình<br /> 1). Việc gây nhiễm VK tả đã làm chuột ở<br /> lô này bị bệnh và nhanh chóng chết, theo<br /> diễn biến của bệnh tả không được điều trị.<br /> <br /> * Xử lý số liệu:<br /> Xử lý số liệu theo các phương pháp<br /> thống kê y sinh học, sử dụng mô hình<br /> phân tích sống sót (survival analysis),<br /> phân tích xác xuất sống sót tích lũy<br /> Kaplan-Meier bằng phần mềm SPSS 16.0.<br /> Dùng kiểm định Log Rank để so sánh sự<br /> khác biệt giữa các lô nghiên cứu. Sự khác<br /> biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.<br /> <br /> Hình 1: Chuột lô chứng bệnh lý. Các quai ruột<br /> căng đầy chất lỏng, hậu môn dính dịch phân.<br /> <br /> 19<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> - Gây nhiễm VK tả chuột ở các lô 3, 4, 5 như lô 2, sau đó cho uống hỗn hợp 2 kháng<br /> thể, IgY kháng VK tả và IgY kháng độc tố tả (tương ứng). Kết quả nghiên cứu 1 được<br /> trình bày ở bảng 3 và biểu đồ 1.<br /> Bảng 3: Tác dụng của chế phẩm nghiên cứu lên thời gian sống thêm (giờ) của<br /> chuột nhiễm VK tả (n = 20).<br /> Thời gian sống thêm trung bình<br /> Lô nghiên cứu<br /> <br /> x<br /> <br /> ± SE<br /> <br /> Giá trị p<br /> (Log Rank test)<br /> <br /> Thời gian<br /> sống thêm<br /> tối thiểu<br /> <br /> Tỷ lệ sống<br /> sau 72 giờ<br /> (%)<br /> <br /> Lô 1 (chứng sinh lý)<br /> <br /> (1)<br /> <br /> 68,82 ± 1,36<br /> <br /> p3-1,4 > 0,05<br /> <br /> 48,96<br /> <br /> 65 %<br /> <br /> Lô 2 (chứng bệnh lý)<br /> <br /> (2)<br /> <br /> 14,12 ± 0,76<br /> <br /> p3-5 < 0,01<br /> <br /> 9,28<br /> <br /> 0<br /> <br /> Lô 3 (hỗn hợp 2 kháng thể) (3)<br /> <br /> 62,18 ± 2,81<br /> <br /> p4-5 > 0,05<br /> <br /> 32,69<br /> <br /> 50%<br /> <br /> Lô 4 (IgY kháng VK tả)<br /> <br /> (4)<br /> <br /> 51,04 ± 4,54<br /> <br /> p4 -1 < 0,05<br /> <br /> 15,64<br /> <br /> 40%<br /> <br /> Lô 5 (IgY kháng độc tố tả)<br /> <br /> (5)<br /> <br /> 37,43 ± 4,56<br /> <br /> p5 -1, p-2 < 0,001<br /> <br /> 10,62<br /> <br /> 20%<br /> <br /> Biểu đồ 1: Xác suất sống sót tích lũy Kaplan-Meier.<br /> Kết quả từ bảng 3 và biểu đồ 1 cho<br /> thấy các chế phẩm sử dụng có tác dụng<br /> kéo dài thời gian sống của chuột có ý<br /> nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý<br /> (p < 0,001), Log Rank test. So sánh các<br /> thông số khác như thời gian sống thêm<br /> tối thiểu, tỷ lệ % sống sau 72 giờ đều cải<br /> thiện rõ rệt. Phẫu tích chuột quan sát bên<br /> trong thấy tình trạng các quai ruột căng,<br /> 20<br /> <br /> đầy chất lỏng và hậu môn dính dịch phân<br /> giảm rõ rệt so với lô chứng bệnh lý.<br /> Hỗn hợp 2 kháng thể có tác dụng kéo<br /> dài thời gian sống của chuột tốt nhất,<br /> khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô<br /> dùng IgY kháng độc tố tả. Thời gian sống<br /> thêm trung bình của chuột ở lô dùng hỗn<br /> hợp 2 kháng thể thậm chí còn tăng đến<br /> mức không khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> <br />