Hoàn thiện yếu tố kỹ thuật của xét nghiệm tìm đột biến mất đoạn vùng AZFa, AZFb và AZFc nhiễm sắc thể Y

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> HOÀN THIỆN YẾU TỐ KỸ THUẬT CỦA XÉT NGHIỆM TÌM ĐỘT BIẾN<br /> MẤT ĐOẠN VÙNG AZFa, AZFb VÀ AZFc NHIỄM SẮC THỂ Y<br /> Nguyễn Minh Hà*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu : Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y đã được xác định có liên quan đến tình<br /> trạng rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng.<br /> Mục tiêu : Hoàn thiện kỹ thuật xét nghiệm phát hiện loại đột biến này.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu : Thử nghiệm một số yếu tố kỹ thuật của xét nghiệm : chọn<br /> loại enzyme Taq polymerase phù hợp, xác định độ nhạy của multiplex PCR mix.<br /> Kết quả : HotStart Taq DNA Polymerase của Qiagen® là enzyme tối ưu cho kỹ thuật nhưng Thermo<br /> Taq Polymerase của ABgene® vẫn cho kết quả vẫn chấp nhận được. Độ nhạy của MPCR mix được xác<br /> định là 5ng DNA/µl trong khi nồng độ DNA tốt nhất cho phản ứng là 20ng/µl.<br /> Kết luận : Đã xác định thành công một số điều kiện kỹ thuật của xét nghiệm, hy vọng kết quả trên sẽ<br /> giúp ích cho các nghiên cứu tiếp theo khảo sát loại đột biến này.<br /> Từ khóa : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor)<br /> <br /> ASTRACT<br /> OPTIMIZATION OF TECHNICAL CONDITIONS FOR THE TEST OF AZFa, AZFb AND AZFc<br /> MICRODELETION<br /> Nguyen Minh Ha * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 – 2011: 23 - 26<br /> Background : Microdeletions in the AZF regions of the Y chromosome are defined to be related to<br /> abnormal spermatogenesis and sperm maturation arrest.<br /> Objectives : This study was carried-out in order to optimize some technical conditions of the AZF<br /> microdeletion test.<br /> Method : we test some technical conditions of the test : choosing the siutable DNA Taq Polymerase,<br /> defining the sensitivity of the multiplex PCR mix.<br /> Results : We suggest that HotStart Taq DNA Polymerase (Qiagen®) is the best enzyme for this test.<br /> However, the result of multiplex PCR with Thermo Taq Polymerase (ABgene®) is also good. The sensitivity<br /> of the multiplex PCR mix is 5ng DNA/µl while the optimal DNA concentration is 20ng/µl.<br /> Conclusion : We have defined some technical conditions of this test and we hope that these results will<br /> be useful for next researches about this mutation.<br /> Keywords : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor)<br /> <br /> *<br /> <br /> Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tp. Hồ Chí Minh<br /> ĐT: 0989 21 23 82<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: ThS. Nguyễn Minh Hà<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản<br /> <br /> Email: drnguyenminhha@gmail.com<br /> <br /> 23<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU<br /> Trước đây vô sinh thường được cho là do<br /> người vợ. Tuy nhiên khi các khảo sát trên nam<br /> giới được đẩy mạnh thì có 35-40% nguyên<br /> nhân vô sinh là do người chồng, trong đó<br /> khoảng 90% có liên quan đến các bất thường<br /> sinh tinh (2). Các đột biến mất đoạn vùng AZF<br /> của nhiễm sắc thể Y, được tác giả Tiepolo và<br /> Zuffardi báo cáo lần đầu tiên năm 1976, có<br /> liên quan đến sự rối loạn sinh tinh và gián<br /> đoạn trưởng thành tinh trùng do đó làm giảm<br /> mạnh khả năng có con (4). Đứng trước nhu cầu<br /> cần có một công cụ khảo sát loại rối loạn di<br /> truyền này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu<br /> nhằm hoàn thiện các yếu tố kỹ thuật của xét<br /> nghiệm tìm đột biến vùng AZFa, b và c trên<br /> nhiễm sắc thể Y.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH<br /> Lấy 3mL máu ngoại biên chống đông bằng<br /> EDTA. Ly trích DNA bộ gen từ tế bào bạch<br /> cầu với tỷ số tinh khiết từ 1,8 – 2,0.<br /> Mỗi mẫu DNA được chạy 2 phản ứng<br /> Multiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứng<br /> khuếch đại 5 đoạn DNA (gồm 2 đoạn gen<br /> ZFY, SRY là chứng nội tại và 3 đoạn gen<br /> thuộc 3 vùng AZFa, b, c). Các cặp mồi sử<br /> dụng phát hiện được 95% trường hợp mất<br /> đoạn trên vùng AZF (3). Chứng nam, chứng nữ<br /> (DNA của một người nam và người nữ bình<br /> thường) và chứng nước được chạy song song<br /> với mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Lần lượt thay<br /> đổi các loại Taq DNA polymerase (HotStart<br /> Taq polymerase của Qiagen®, Thermo Taq<br /> của<br /> ABgene®,<br /> Taq<br /> polymerase<br /> của<br /> Promega®) với lượng không đổi là 2u/50 μl<br /> phản ứng để xác định được loại enzyme tối<br /> ưu cho phản ứng. Nồng độ trong một phản<br /> ứng của Mg2+ là 6.5mM, của mồi là 2µmol mỗi<br /> loại và của dNTPs là 0,3mM. Chu kỳ nhiệt<br /> phản ứng là 950C 6’ , 940C 30’’ , 550C 30’’, 720C<br /> 60’’ , 35 chu kỳ, 720C 10’. Sản phẩm PCR được<br /> chạy điện di ở 100V trong 40 phút trên gel<br /> agarose 2,5%, với chất phát quang ethidium<br /> <br /> 24<br /> <br /> bromide và thước đo 100 đôi base. Đọc kết<br /> quả dưới đèn UV và chụp hình lưu lại (3).<br /> Bảng 1: Các đoạn gen được khuếch đại trong<br /> phần phản ứng<br /> Đoạn khuếch đại Kích thước(đôi base)<br /> <br /> Phản ứng<br /> 1<br /> <br /> Phản ứng<br /> 2<br /> <br /> ZFY ( chứng )<br /> SRY (chứng )<br /> sY86 ( AZFa )<br /> sY127 ( AZFb )<br /> sY254 (AZFc)<br /> ZFY ( chứng )<br /> SRY (chứng )<br /> sY84 ( AZFa )<br /> sY134 ( AZFb )<br /> sY255 (AZFc)<br /> <br /> 495<br /> 472<br /> 320<br /> 274<br /> 380<br /> 495<br /> 472<br /> 326<br /> 301<br /> 126<br /> <br /> Xác định độ nhạy của MPCR mix bằng cách<br /> pha loãng liên tiếp DNA đã biết trước nồng độ<br /> của một người nam bình thường (không vô<br /> sinh, tinh trùng đồ bình thường, đã làm xét<br /> nghiệm không bị đột biến tại vùng AZF) với<br /> nước cất, bắt đầu từ 20 ng/μl (1,3). Các DNA pha<br /> loãng này sẽ được cho vào PCR mix để đạt các<br /> nồng độ DNA cuối trong phản ứng là 10 ng/μl,<br /> 5 ng/μl và 2,5 ng/μl. Dùng một PCR mix làm<br /> chứng (-) và dung dịch cho vào PCR mix này là<br /> nước cất. Độ nhạy của PCR mix được xác định<br /> là lượng DNA tối thiểu được cho vào ống phản<br /> ứng mà vẫn cho được đủ và rõ 5 sản phẩm<br /> khuếch đại mong muốn thấy được trên gel điện<br /> di (ứng với mỗi phản ứng).<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> 1.Thử nghiệm các loại Taq polymerase :<br /> Kỹ thuật hot start PCR (sử dụng HotStart<br /> Taq DNA Polymerase) có ưu điểm là hạn chế<br /> được sự hình thành sản phẩm không đặc hiệu<br /> (rất quan trọng khi thiết kế PCR đa mồi)<br /> nhưng lại có giá thành cao. Do đó, chúng tôi<br /> thử nghiệm xét nghiệm với 3 loại DNA Taq<br /> polymerase khác nhau (Hình 1)<br /> Hình 1 cho thấy phản ứng chạy bằng<br /> HotStart Taq DNA Polymerase của Qiagen®<br /> cho lượng sản phẩm nhiều nhất đồng thời<br /> hoàn toàn không có các sản phẩm phụ không<br /> mong muốn. Do đó, chúng tôi đề nghị đây là<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> loại Taq polymerase<br /> nghiệm này.<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5 M<br /> <br /> Phản ứng 1<br /> <br /> tối<br /> <br /> ưu<br /> <br /> cho<br /> <br /> xét<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> quả rõ ràng là 5 ng/μl, trong khi nồng độ<br /> DNA tối ưu 20 ng/μl.<br /> <br /> 1 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4 5<br /> <br /> Phản ứng 2<br /> <br /> Hình 1 : Hình ảnh gel khi chạy phản ứng MPCR<br /> với các loại Taq DNA Polymerase khác nhau.<br /> <br /> Hình 2 : Hình ảnh gel với các nồng độ DNA pha<br /> loãng<br /> <br /> M : thước đo 100 đôi base – Giếng 1: HotStart Taq<br /> DNA Polymerase của Qiagen® -Giếng 2: nước cất<br /> – Giếng 3: Taq DNA Polymerase (buffer màu) của<br /> Promega® - Giếng 4 : Thermo Taq DNA<br /> Polymerase của ABgene® - Giếng 5: Taq DNA<br /> Polymerase (buffer không màu) của Promega® -<br /> <br /> M : thước đo 100 đôi base - Giếng 1, 6: nồng độ<br /> DNA 20ng/μl - Giếng 2, 7: nồng độ DNA<br /> 10ng/μl – Giếng 3, 8: nồng độ DNA 5 ng/μl –<br /> Giếng 4, 9: nồng độ DNA 2,5 ng/μl – Giếng 5,<br /> 10: nước.<br /> <br /> Phản<br /> <br /> ứng<br /> <br /> sử<br /> <br /> dụng<br /> <br /> Thermo<br /> <br /> Taq<br /> <br /> Polymerase của ABgene® và Taq DNA<br /> Polymerase của Promega® cho kết quả kém<br /> hơn : lượng sản phẩm tạo thành ít hơn nhưng<br /> cũng không có sản phẩm phụ không đặc hiệu.<br /> Trong đó, phản ứng sử dụng Taq DNA<br /> Polymerase của ABgene® cho kết quả rõ hơn<br /> phản ứng sử dụng Taq DNA Polymerase của<br /> Promega®. Vì vậy, nếu để hạ giá thành xét<br /> nghiệm, có thể chọn Taq polymerase của<br /> ABgene® với giá thành trung bình mà vẫn<br /> cho hình ảnh kết quả chấp nhận được.<br /> <br /> 2. Xác định độ nhạy của kỹ thuật<br /> (MPCR mix):<br /> Hình 2 cho thấy bắt đầu từ nồng độ 2,5<br /> ng/μl hình ảnh gel không còn rõ ràng để nhận<br /> <br /> Phản ứng<br /> <br /> 3. Kết quả áp dụng kỹ thuật xét nghiệm<br /> trên DNA bệnh nhân:<br /> Áp dụng quy trình xét nghiệm (sử dụng<br /> Thermo Taq polymerase của ABgene®) trên 3<br /> mẫu DNA bệnh nhân nam vô sinh vô căn<br /> (được chẩn đoán bởi Khoa Hiếm Muộn bệnh<br /> viện Từ Dũ).<br /> Ở hình 3, giếng số 1, DNA bệnh nhân có<br /> đủ 5 vạch tương ứng 5 đoạn được khuếch đại<br /> trên mỗi phản ứng, do đó bệnh nhân không bị<br /> đột biến. Ở giếng số 2, DNA bệnh nhân mất<br /> vạch ở vị trí khoảng 380 đôi base (tương ứng<br /> sY254 của AZFc) trên phản ứng 1 và vạch ở vị<br /> trí khoảng 126 đôi base (tương ứng sY255 của<br /> AZFc) trên phản ứng 2. Do đó bệnh nhân bị<br /> mất đoạn tại AZFc. Ở giếng số 3, DNA bệnh<br /> nhân mất vạch ở vị trí khoảng 274 đôi base<br /> (tương ứng sY127 của AZFb) trên phản ứng 1<br /> và vạch ở vị trí khoảng 301 đôi base (tương<br /> ứng sY134 của AZFb) trên phản ứng 2. Do đó<br /> bệnh nhân bị mất đoạn tại AZFb.<br /> <br /> thấy tất cả 5 vạch trên mỗi phản ứng. Do đó,<br /> chúng tôi đề nghị nồng độ DNA tối thiểu mà<br /> MPCR mix có thể khuếch đại để xác định kết<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản<br /> <br /> 25<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> MPCR mix là 5ng/µl.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> Hình 3 : Kết quả Phần phản ứng cơ bản của xét<br /> nghiệm trên 3 DNA bệnh nhân.<br /> M : thước đo 100 đôi base – Giếng 1 : DNA bệnh<br /> nhân không mất đoạn - Giếng 2: DNA bệnh nhân<br /> mất đoạn AZFc - Giếng 3 : DNA bệnh nhân mất<br /> đoạn AZFb - Giếng 4 : chứng nam - Giếng 5 :<br /> chứng nữ - Giếng : nước cất<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Chúng tôi đã xác định được một số điều<br /> kiện kỹ thuật của xét nghiệm tìm đột biến mất<br /> đoạn vùng AZFa, b và c. Phản ứng Multiplex<br /> PCR sẽ cho kết quả tối ưu nếu được chạy<br /> bằng HotStart Taq DNA Polymerase của<br /> Qiagen®. Tuy nhiên Thermo Taq Polymerase<br /> của ABgene® vẫn cho kết quả chấp nhận<br /> được. Nồng độ DNA tối ưu nên sử dụng cho<br /> phản ứng là 20ng/μl trong khi độ nhạy của<br /> <br /> 26<br /> <br /> 1.<br /> <br /> Krausz C, Forti G, Ken M. (2003). Review : The Y<br /> chromosome and male fertility and infertility. International<br /> journal of andrology. 26 : 70 – 75.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> Matsumoto AM. (1998). Pathophysiology of male infertility.<br /> Infertility Evaluation and Treatment – Key, Chang, Rebar,<br /> Soules 37 : 557 – 565.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Simoni M., Bakker E., Krausz C. (2004). EAA/EMQN best<br /> practice giudelines for molecular diagnosis of Ychromosomal microdeletions. State of the art 2004. Int. J.<br /> Andro. 27:240-249.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Tiepolo L. and Zuffardi O. (1976). Localization of factors<br /> controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion<br /> of the human Y chromosome long arm. Hum. Genet. 34 : 119<br /> – 124.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Stahl P.J., Masson P., Mielnik A. et al (2009). A decade of<br /> experience emphasize that testing for Y microdeletions is<br /> essential in American men with azoospermia and severe<br /> oligozoospermia. The Official Journal of the American Society<br /> for Reproductive Medicine. Published online 06 November<br /> 2009. http://www.fertstert.org/article/S0015-0282(09)036851/abstract<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Y chromosome Microdeletions : To determine the etiology<br /> of azoospermia or oligospermia resulting in male infertility.<br /> Published online August 2009. http://www.arupconsult.com<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> <br />