Kết quả bước đầu nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013<br /> <br /> KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI PHÔI SAU<br /> SINH THIẾT ĐỂ CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN TRƢỚC CHUYỂN PHÔI<br /> Nguyễn Ngọc Diệp*; Nguyễn Thanh Tùng*; Quản Hoàng Lâm*<br /> TÓM TẮT<br /> Việc đánh giá về hình thái phôi trong thụ tinh trong ống nghiệm chưa phản ánh đầy đủ chất<br /> lượng thực của phôi. Để nâng cao chất lượng trong điều trị, chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi<br /> (Preimplantation Genetic Diagnosis/PGD) là một trong những yêu cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn.<br /> Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá thay đổi hình thái của phôi sau sinh thiết. 60 phôi<br /> được chia làm 2 nhóm. Nhóm 1: 30 phôi được sinh thiết vào ngày 3, tiếp tục nuôi cấy và lượng giá<br /> hình thái phôi sau sinh thiết, so sánh với 30 phôi nhóm chứng. Kết quả: tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ<br /> lệ phôi sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính của phôi và độ dày màng trong suốt thay đổi<br /> không có ý nghĩa thống kê.<br /> * Từ khóa: Hình thái phôi; Chẩn đoán di truyền; Chuyển phôi.<br /> <br /> initial results of embryo morphology after biopsy in<br /> preimplantation genetic diagnosis<br /> Summary<br /> In vitro fertilization, morphological assessment not fully reflect the true quality of the embryos.<br /> To improve the quality of treatment, the preimplantation genetic diagnosis is one of the critical<br /> requirements, urgent and practical. We conducted a study to examine the assessment of embryo<br /> morphology changes after biopsy. 60 embryos were divided into 2 groups, group 1: 30 embryo<br /> biopsy on day 3, and continue culture, morphology evaluation after biopsy, compared with the control<br /> group embryos. Results: fragment ratio, embryo survival rate, blastocyst forming rate, the diameter of<br /> the embryo and ZP thickness change not significantly.<br /> * Key words: Embryo morphology; Genetic diagnosis; Embryo implantation.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay, hầu như việc lựa chọn phôi<br /> đều dựa trên những tiêu chuẩn về hình thái<br /> của phôi. Tuy nhiên, việc đánh giá về hình<br /> thái chưa phản ánh đầy đủ chất lượng thực<br /> của phôi, nếu chỉ dựa vào các thông số về<br /> <br /> hình thái, kết quả điều trị thụ tinh ống<br /> nghiệm bị hạn chế. Nhiều phôi có chỉ số<br /> hình thái cao, nhưng không làm tổ được<br /> hoặc không tạo ra trẻ khoẻ mạnh. Ngược lại,<br /> có khi phôi có các chỉ số hình thái kém hơn,<br /> lại tạo ra em bé bình thường. Trong nhiều<br /> trường hợp, lý do phôi không phát triển,<br /> <br /> * Häc viÖn Qu©n y<br /> Ng-êi ph¶n håi (Corresponding): NguyÔn Ngäc DiÖp (nndiep301@gmail.com)<br /> Ngµy nhËn bµi: 20/5/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 20/6/2013<br /> Ngµy bµi b¸o ®-îc ®¨ng: 24/6/2013<br /> <br /> 33<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013<br /> không làm tổ được hoặc bị sảy thai sớm là<br /> do chất lượng của phôi. Ví dụ, bị rối loạn về<br /> số lượng nhiễm sắc thể gây ảnh hưởng đến<br /> sự sống và phát triển của phôi [4].<br /> Để nâng cao chất lượng trong điều trị<br /> cũng như đảm bảo cho ra đời một thế hệ<br /> khoẻ mạnh về thể lực, sáng suốt về tinh<br /> thần, đồng thời sàng lọc một số bệnh di<br /> truyền, việc chẩn đoán di truyền trước chuyển<br /> phôi (PGD) là một trong những yêu cầu<br /> quan trọng, cấp thiết và thực tiễn. Nguyên<br /> tắc kỹ thuật của PGD dựa trên việc thực<br /> hiện thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON)<br /> để tạo phôi, sau đó sinh thiết phôi và phân<br /> tích nhiễm sắc thể hoặc ADN bằng kỹ thuật<br /> FISH, CGH hoặc PCR [2].<br /> Kỹ thuật sinh thiết phôi là kỹ thuật xâm<br /> lấn, đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ, chính xác.<br /> Vì vậy, trong quá trình thực hiện có thể ảnh<br /> hưởng đến chất lượng của phôi. Song song<br /> với công việc hoàn thiện quy trình sinh thiết<br /> phôi, chúng tôi tiến hành đánh giá hình thái<br /> phôi, đồng thời theo dõi khả năng phát triển<br /> của phôi sau sinh thiết. Trên cơ sở đó<br /> chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm:<br /> Đánh giá sự thay đổi hình thái của phôi sau<br /> sinh thiết.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - 60 phôi người còn dư khi TTTON.<br /> Chia đối tượng nghiên cứu thành 2 nhóm:<br /> - Nhóm I: 30 phôi sinh thiết vào ngày 3<br /> trong quá trình nuôi cấy.<br /> - Nhóm II: 30 phôi không sinh thiết (nhóm<br /> chứng).<br /> * Tiêu chuẩn lựa chọn phôi để sinh thiết:<br /> phôi được nuôi cấy đến ngày thứ 3 trong<br /> môi trường nuôi cấy TTTON. Phôi có tế bào<br /> đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment)<br /> < 20% (phôi độ III, độ IV).<br /> <br /> * Tiêu chuẩn loại trừ: phôi giai đoạn<br /> sớm độ I, độ II; các tế bào không đồng đều,<br /> tỷ lệ mảnh vỡ bào tương ≥ 20%.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Kích thích buồng trứng:<br /> - Phác đồ dài, sử dụng GnRHa để ức<br /> chế hormon FSH, LH của tuyến yên, điều<br /> hoà xuống 14 ngày, bắt đầu từ ngày 21 của<br /> chu kỳ kinh. Sau đó sử dụng rFSH tái tổng<br /> hợp kích thích nang trứng.<br /> - Phác đồ ngắn: dùng FSH từ N2 chu kỳ<br /> kinh.<br /> - Phác đồ GnRH antagonists (Cetrotide,<br /> Serono, Mỹ): bệnh nhân (BN) được kích thích<br /> bằng FSH tái tổng hợp (Gonal-F, Serono),<br /> có thể kết hợp với menopur từ ngày thứ 2<br /> của chu kỳ kinh. Sử dụng antagonist sau<br /> 5 - 6 ngày dùng FSH.<br /> HCG (5.000 - 10.000 IU Profasi, Serono;<br /> Pregnyl, Organon) chỉ định khi có ít nhất<br /> trên 2 nang noãn có kích thước > 17 mm.<br /> * Đánh giá thụ tinh và quá trình nuôi cấy<br /> phôi:<br /> Khoảng 16 - 18 giờ sau khi tiêm tinh<br /> trùng vào trứng, đánh giá trứng xem có thụ<br /> tinh hay không. Nếu đã thụ tinh tạo thành<br /> phôi sẽ xuất hiện 2 tiền nhân và 2 thể cực.<br /> Sau đó, đánh giá phôi ghi điểm ở từng thời<br /> điểm 36; 48 giờ sau thụ tinh. thu thập số<br /> lượng và hình thể của nhân, tế bào phôi và<br /> thể loại mảnh vỡ để đánh giá chất lượng<br /> phôi [1, 3].<br /> <br /> * Sinh thiết tế bào phôi:<br /> <br /> 34<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013<br /> Phương pháp chi tiết sinh thiết một phôi bào từ phôi đang thời kỳ phân cắt bằng tia<br /> laser như sau: dùng kim sinh thiết hút nhẹ nhàng 1 tế bào của phôi vào ngày thứ 3 (66 - 68<br /> giờ sau tiêm tinh trùng) khi phôi có ít nhất 4 tế bào và có số lượng mảnh vỡ không quá<br /> 30%. Sau đó, chuyển phôi lại vào môi trường nuôi cấy cho đến ngày 5 [2].<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hình thái phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết.<br /> Bảng 1: Hình thái phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết ở thời điểm 3 ngày tuổi.<br /> NGÀY 3<br /> <br /> NGÀY 4<br /> <br /> NGÀY 5<br /> <br /> X ± SD<br /> (tỷ lệ mảnh vỡ bào<br /> tương) (%)<br /> <br /> X ± SD<br /> (tỷ lệ phôi sống sót)<br /> <br /> X ± SD<br /> (tỷ lệ tạo thành blastocyst)<br /> <br /> p<br /> <br /> NHÓM (n = 30)<br /> <br /> Sinh thiết (I)<br /> <br /> 8,63<br /> <br /> 92,22<br /> <br /> 89,81<br /> <br /> p1-2 < 0,01<br /> <br /> Chứng (II)<br /> <br /> 8,82<br /> <br /> 93,13<br /> <br /> 90,10<br /> <br /> NGÀY<br /> <br /> Tại thời điểm ngày 3, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tại thời điểm ngày 4, tỷ lệ phôi sống sót<br /> và tại thời điểm ngày 5, tỷ lệ tạo thành bastocyst giữa 2 nhóm trong quá trình phát triển sau<br /> sinh thiết khác biệt không có ý nghĩa thống kê.<br /> 2. Đƣờng kính của phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết.<br /> Bảng 2:<br /> NGÀY<br /> <br /> NGÀY 3<br /> <br /> NGÀY 4<br /> <br /> NGÀY 5<br /> <br /> NHÓM (n = 30)<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> Sinh thiết (I)<br /> <br /> 150,20 ± 7,85<br /> <br /> 151,50 ± 6,32<br /> <br /> 152,40 ± 6,42<br /> <br /> Chứng (II)<br /> <br /> 149,50 ± 8,15<br /> <br /> 152,50 ± 5,32<br /> <br /> 152,60 ± 7,45<br /> <br /> p<br /> <br /> p1-2 < 0,01<br /> <br /> 3. Độ dày màng trong suốt của phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết ở thời<br /> điểm 3 ngày tuổi.<br /> Bảng 3:<br /> NGÀY<br /> <br /> NGÀY 3<br /> <br /> NGÀY 4<br /> <br /> NGÀY 5<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> Sinh thiết (I)<br /> <br /> 16,10 ± 1,12<br /> <br /> 15,80 ± 1,13<br /> <br /> 15,70 ± 1,14<br /> <br /> Chứng (II)<br /> <br /> 16,80 ± 1,20<br /> <br /> 16,30 ± 1,20<br /> <br /> 16,20 ± 1,22<br /> <br /> NHÓM (n = 30)<br /> <br /> p1-2 < 0,01<br /> <br /> * Một số hình ảnh phôi trong quá trình<br /> sinh thiết và nuôi cấy dưới kính hiển vi đảo<br /> <br /> ngược Olympus gắn phần mềm trên máy<br /> sinh thiết Saturn Active x400:<br /> <br /> 36<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013<br /> Hình 3: Phôi sau sinh thiết 36 giờ.<br /> <br /> Hình 1: Phôi trước sinh thiết.<br /> <br /> Hình 4: Phôi thoát màng sau sinh thiết<br /> 48 giờ.<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Hình 2: Phôi sau sinh thiết 0 giờ.<br /> <br /> Phương pháp kích thích buồng trứng<br /> trong hỗ trợ sinh sản thường tạo được<br /> nhiều trứng để thụ tinh và tạo ra nhiều phôi<br /> cho mỗi chu kỳ điều trị. Những năm trước<br /> đây, hầu hết các trung tâm điều trị TTTON<br /> đều có xu hướng chuyển nhiều phôi vào<br /> buồng tử cung để tăng tỷ lệ có thai, nhưng<br /> đồng thời cũng làm tăng nguy cơ đa thai.<br /> Đa thai thường liên quan nhiều đến biến<br /> chứng cho cả mẹ và con. Ví dụ, mẹ có thể<br /> bị tiền sản giật, chảy máu sau đẻ, phải cắt<br /> bỏ tử cung hoặc đái đường khi mang thai,<br /> trẻ sơ sinh dễ bị nhẹ cân, đẻ non, bại não<br /> và các dị tật bẩm sinh. Vì vậy, hiện nay<br /> nhiều trung tâm TTTON đang cố gắng giới<br /> hạn số lượng phôi chuyển, có thể chuyển<br /> đơn phôi vào buồng tử cung và giảm nguy<br /> cơ nói trên, do ®ã giảm số lượng đa thai<br /> đáng kể. Tuy nhiên, việc giảm số lượng phôi<br /> chuyển lại làm giảm tỷ lệ có thai trong điều<br /> trị hỗ trợ sinh sản. Nguồn gốc của vấn đề là<br /> do phôi được chuyển không có khả năng<br /> sống và phát triển như nhau. Để làm tăng tỷ<br /> lệ có thai như mong muốn, giảm số lượng<br /> phôi chuyển vào buồng tử cung, đồng thời<br /> giảm tỷ lệ nguy cơ cho mẹ và con, điều cần<br /> <br /> 37<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013<br /> thiết là phải chọn lọc được phôi có khả<br /> năng làm tổ cao nhất để chuyển phôi.<br /> Phương pháp phổ biến được sử dụng ở đa<br /> số các trung tâm TTTON để đánh giá phôi<br /> tốt hay xấu phần lớn dựa vào các chỉ số<br /> hình thái, ví dụ như số lượng, kích thước<br /> của tế bào phôi, sự có mặt và phân bố các<br /> mảnh vỡ bào tương, đa nhân và tốc độ<br /> phân chia của phôi. Đánh giá phôi theo hình<br /> thái nói trên tuy chưa thể đảm bảo được<br /> yêu cầu quan trọng nhất là khả năng sống<br /> và phát triển bình thường của phôi, nhưng<br /> có ưu điểm là nhanh và dễ dàng thực hiện.<br /> Đề tài chẩn đoán di truyền trước chuyển<br /> phôi nghiên cứu chất lượng của phôi trước<br /> khi làm tổ nhằm bổ sung thêm kỹ thuật<br /> sàng lọc phôi, đồng thời sàng lọc một số<br /> bệnh di truyền trước chuyển phôi. Trong<br /> khuôn khổ đề tài này, đánh giá sự biến đổi<br /> hình thái cấu trúc phôi sau sinh thiết [9] là<br /> một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam, chưa có<br /> công trình nào nghiên cứu một cách bài bản.<br /> Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học và thực<br /> tiễn, góp phần nâng cao chất lượng trong<br /> điều trị vô sinh.<br /> Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng<br /> cách phân độ phôi của Andres Salumets<br /> và CS (2001) [10], cách phân độ phôi này<br /> đơn giản phù hợp với thời gian ngắn 2 - 3<br /> phút khi quan sát phôi ở ngoài tủ nuôi<br /> cấy. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy<br /> cách đánh giá hình thái phôi này hoàn<br /> toàn có thể tiên lượng được khả năng<br /> sống của phôi sau sinh thiết để chuyển<br /> cho bệnh nhân [3].<br /> Trong nghiên cứu, chúng tôi đã chụp<br /> ảnh tất cả phôi trước và sau sinh thiết,<br /> tính tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi<br /> sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đo độ<br /> dày màng trong suốt và đường kính phôi.<br /> <br /> Kết quả cho thấy cấu trúc hình thái phôi<br /> ngày 3, ngày 5 thay đổi trước và sau sinh<br /> thiết về đường kính phôi, độ dày màng<br /> trong suốt không có ý nghĩa thống kê<br /> (p > 0,05). Có thể đây là một minh chứng<br /> cho quy trình sinh thiết phôi mà chúng tôi<br /> đang sử dụng là ổn định, đáng tin cậy.<br /> Kết quả nghiên cứu này phù hợp với<br /> Trương Đình Kiệt và các tác giả khác trên<br /> thế giới [2, 5, 6].<br /> KẾT LUẬN<br /> Qua nghiên cứu bước đầu, chúng tôi rút<br /> ra kết luận sau:<br /> Quy trình sinh thiết bằng tia laser và kỹ<br /> thuật tiến hành một cách chu đáo và tỉ mỉ,<br /> không ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như<br /> quá trình phát triển của phôi. Thể hiện bằng<br /> tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi sống<br /> sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính<br /> của phôi và độ dày màng trong suốt thay<br /> đổi không có ý nghĩa thống kê.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Đoàn Thị Hằng. Nghiên cứu biến đổi hình<br /> thái cấu trúc phôi người ngày 3, ngày 5 trước<br /> đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thuỷ tinh<br /> hóa. Luận án Tiến sỹ Y học. 2013.<br /> 2. Trương Đình Kiệt, Hồ Mạnh Tường. Thiết<br /> lập quy trình kỹ thuật trong chẩn đoán di truyền<br /> tiền làm tổ (PGD) các phôi TTTON. Báo cáo đề<br /> tài cấp thành phố 4/2011.<br /> 3. Nguyễn Thanh Tùng. Nghiên cứu hình thái<br /> cấu trúc hợp tử giai đoạn tiền nhân và phôi hai<br /> ngày tuổi trên bệnh nhân TTTON. Luận án Tiến<br /> sỹ Y học. 2011.<br /> 4. Gardner D.K, Lane M. Embryo culture.<br /> Textbook of Assisted Reproductive Techniques.<br /> 2001, pp.203-222.<br /> <br /> 38<br /> <br />