Luận án tiến sĩ Thú y: Một số đặc điểm dịch tễ học và sinh học bệnh sán lá gan lớn trên bò ở đồng bằng sông cửu long và thử hiệu quả của thuốc tẩy trừ

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:239

Thêm vào BST

Báo xấu

75
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm xác định được loài, sự phân bố, đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Đề xuất được biện pháp tẩy trừ bệnh sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Thú y: Một số đặc điểm dịch tễ học và sinh học bệnh sán lá gan lớn trên bò ở đồng bằng sông cửu long và thử hiệu quả của thuốc tẩy trừ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG HÀ HUỲNH HỒNG VŨ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÕ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã số 62640102 Cần Thơ – 2018
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG HÀ HUỲNH HỒNG VŨ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÕ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã số 62640102 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGUYỄN HỮU HƢNG Cần Thơ - 2018 2
LỜI CẢM TẠ Trong suốt thời gian học tập thực hiện đề tài và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân. Nhân dịp này, tôi không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân thành đến những người đã quan tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ - đấng sinh thành - cùng anh chị em trong gia đình thân yêu luôn là nguồn động lực thúc đẩy tôi nỗ lực và phấn đấu. Cảm ơn vợ và các con đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian học tập thật tốt. Tất cả những người thân yêu nhất đã dành cho tôi rất nhiều tình cảm, sự khuyến khích và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án tiến sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Hữu Hưng, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận án. Đặc biệt, thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và niềm đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự tự tin, nỗ lực, cố gắng không ngừng và không chùn bước trước những khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án tiến sĩ. Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Bộ môn Thú Y đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian tiến hành đề tài. Xin ghi nhớ công ơn của quý Thầy, Cô Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã hết lòng truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học. Xin cảm ơn: Các bạn, các em sinh viên trong phòng thí nghiệm ký sinh trùng Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ. Các anh, chị, bạn nghiên cứu sinh, học viên cao học và các em sinh viên đại học đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, chia sẻ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi trong suốt thời gian qua. I
Ban lãnh đạo và các cán bộ kỹ thuật Chi cục Chăn nuôi thú y tỉnh, trạm chăn nuôi thú y huyện, các hộ chăn nuôi bò ở các tỉnh An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long và Trà Vinh, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong việc thu mẫu. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Đồng Tháp, Ban Chủ nhiệm Khoa Tài nguyên và Môi trường, Trường Đại học Đồng Tháp đã tạo điều kiện để tôi được tham gia học tập nâng cao trình độ chuyên môn. Các bạn đồng nghiệp đã không ngừng động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng xin kính chúc tất cả mọi người thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc Tác giả luận án Hà Huỳnh Hồng Vũ II
TÓM LƢỢC Bệnh sán lá gan là một trong những bệnh ký sinh trùng quan trọng không những gây ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe vật nuôi mà còn gây thiệt hại kinh tế đáng kể đến ngành chăn nuôi. Chính vì vậy đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu những đặc điểm hình thái, dịch tễ học và sinh học của sán lá gan lớn (SLGL) trên bò ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Với các mục tiêu cụ thể như sau: xác định thành phần loài sán lá gan lớn đang lưu hành tại ĐBSCL, nghiên cứu vòng đời phát triển của loài Fasciola sp. từ giai đoạn bên ngoài môi trường và bên trong ký chủ. Ngoài ra, đề tài sẽ góp phần hoàn thiện mô tả triệu chứng lâm sàng, khảo sát bệnh tích đại thể, vi thể và thử nghiệm thuốc tẩy trừ sán lá gan lớn trên bò. Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2013 đến tháng 6/2017 trên bò tại 6 tỉnh ĐBSCL với các kết quả thu được như sau: Bò tại 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ nhiễm chung là 20,50%. Trong đó, bò địa phương nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ nhiễm cao nhất (21,55%) kế đến là bò lai Sind (20,86%) và tỷ lệ nhiễm thấp nhất ở bò sữa (9,15%). Bò nhiễm sán lá gan có khuynh hướng tăng dần theo lứa tuổi, thấp nhất là bò 2 năm (31,38%). Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở bò nuôi bán chăn thả (26,74%) cao hơn bò nuôi nhốt (10,55%). Phương pháp mổ khám bò tìm sán lá gan lớn có tỷ lệ nhiễm tương đồng với phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng (22,01% với cường độ nhiễm 9,93±0,34 sán/cá thể; so với phương pháp xét nghiệm phân 20,50%). Bò nuôi tại ĐBSCL chịu ảnh hưởng tác động của mùa vụ, bò nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ cao nhất là vào mùa khô (26,07%) và thấp nhất là mùa mưa (14,79%). Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở bò nuôi tại ĐBSCL thay đổi theo vùng sinh thái, bò nuôi ở vùng sinh thái nước ngọt nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ cao nhất là 24,14% và thấp nhất là bò nuôi ở vùng sinh thái nước mặn và lợ với tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 9,01%. Phân tích định danh SLGL bằng phương pháp hình thái học, kỹ thuật sinh học phân tử PCR-RFLP và giải trình tự gene cho thấy các mẫu sán lá gan lớn ở ĐBSCL đều là loài Fasciola gigantica. Tỷ lệ tương đồng giữa các mẫu sán lá gan F.gigantica thu thập tại ĐBSCL cao dao động từ 99,6% đến 100%. Vòng đời SLGL Fasciola gigantica trên bò phát triển qua các giai đoạn từ trứng Fasciola gigantica trong môi trường có nước phát triển thành mao ấu (miracidium) và thoát ra khỏi trứng sau 10-19 ngày, miracidium bơi lội trong môi trường nước với thời gian từ 10 đến 12 giờ sau khi nở. Vào trong vật chủ trung III
gian ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis, miracidium phát triển đến sporocyst (bào ấu) là khoảng 10 ngày, sporocyst đến redia (lôi ấu) là từ 4 đến 28 ngày, redia đến cercaria (vĩ ấu) từ 12 đến 28 ngày. Sau 42 ngày, cercaria thoát ra khỏi ốc, bơi tự do trong nước, sau 1- 2 giờ thì cercaria rụng đuôi hình thành adolescaria (nang ấu). Fasciola gigantica trưởng thành trong gan và ống dẫn mật của bò và đẻ trứng, thải trứng theo phân ra ngoài môi trường sau 111-115 ngày. Bò nhiễm SLGL thể hiện một số triệu chứng lâm sàng phổ biến như là gầy rạc, suy nhươc, tiêu chảy xen kẽ táo bón, ăn ít và nhai lại yếu, niêm mạc nhợt nhạt, lông xù. Ở gan bò nhiễm SLGL có bệnh tích: viêm và xơ, Fasciola được bao bọc trong nhu mô gan làm trên bề mặt gan có những khối u tròn lớn màu nâu, trên bề mặt gan có vết xuất huyết, gan nhạt màu hơi vàng hoặc màu trắng xám. Ống dẫn mật tăng sinh, thành ống dẫn mật xơ hóa, bề mặt ống dẫn mật có nhiều hạt màu đỏ và chảy dịch nhầy đục, vàng nâu và có mùi, calci tích tụ trong ống mật, thành ống dẫn mật dày lên. Bệnh tích vi thể gan nhiễm SLGL cho thấy sán non cư trú trong nhu mô gan, ống dẫn mật tăng sinh, vách ống dẫn mật hóa xơ dày thấm calci ép bể các tiểu thùy gan ở kế cận. Nhu mô gan xuất huyết, ứ huyết, gan vàng, một số vùng trên nhu mô gan bị hoại tử, xuất hiện các nốt mủ và trong nhu mô gan xuất hiện các tổ chức xơ, tiểu thùy gan teo nhỏ do tăng sinh mô liên kết sợi. Thuốc albendazole liều 15mg/kg thể trọng hoặc triclabendazole liều 20mg/kg thể trọng cho uống một liều duy nhất đều có thể tẩy sạch sán lá gan 100%. Thuốc an tòan và không gây phản ứng phụ trong điều trị Từ khóa: Bò, Đồng bằng sông Cửu Long, Fasciola, tỷ lệ nhiễm. IV
ABSTRACT Fasciolosis is an important parasitic disease which has not only great influence on animal health but also causes considerable economic losses of the livestock industry. Therefore, the thesis was aimed at studying the characteristics about morphology, epidemiology as well as biology of liver flukes in cattle in the Mekong Delta. Specifically, the thesis focused on identifying the liver fluke species (Fasciola spp.) and their distribution in the Mekong Delta, studying the full development of life cycle of Fasciola inside and outside the hosts. Besides, the study also documented symptoms, gross lesions and histopathological lesions of Fasciolosis and screening anthelminths in infected cattle. The study was done from November 2013 to June 2017 in cattle in six provinces of the Mekong Delta with many remarkable results. The overall prevalence rate of liver fluke infection in cattle in six surveyed provinces in the Mekong Delta was 20.50%. The local cattle had the highest liver fluke infection rate of 21.55%, followed by Sindhi hybrids cattle with 20.86% and the lowest infection rate belonged to dairy cattle 9.15%. It was also noted that the infection rate of liver fluke in cattle increased according to the age. In fact, under 1 year-cattle, 1-2 year-cattle and those of higher over 2 years had the infectious rate 8.24%, 19.06%, 31.38%; respectively. According to the animal husbandry method, semi free-range cattle had the higher infection rate of Fasciola sp. (26.74%) than confined cattle with 10.55%. Fasciola sp. was detected by post-mortem examination and Benedek’s sedimentation methods, providing quite similar infection rate of 22.01% (intensive rate 9.93±0.34 flukes/individual) and 20.50%; respectively. Seasonal factors also had great impact on the prevalence of Fasciola sp. infection in domestic cattle in the Mekong Delta. The highest prevalence was recorded in the dry season (26.07%) and lowest ones in the rainy season (14.79%). The Fasciola sp. infection rate was influenced by ecological areas; the cattle were in freshwater ecological area had highest rate of Fasciola sp. infection (24.14%) and the lowest was the cattle in sea water and brackish water ecological areas with the rate of Fasciola sp. infection as 9.01%. Analyzing morphological characteristics and molecular biology including PCR-RFLP and sequencing were applied in Fasciola sp. identification. The results from three above mentioned methods have confirmed that liver flukes in cattle in the Mekong Delta were Fasciola gigantica. The high pairwise percentage of nuclear ribosome DNA internal transcribed spacer I (ITS1) sequence among F.gigantica specimens in the Mekong Delta ranged from 99.6% to 100%. V
The development life cycle of Fasciola gigantica in the cattle was decsribed from embryonated egg stage in the water environment and then developed to miracidium and miracidium escaping from the eggs after 10-19 days. Excysted miracidium freely moved in water from 10 hours to 12 hours after hatching. During this time, miracidium was found infected by the approriate intermediate hosts namely Lymnaea swinhoei and Lymnaea viridis snails. In these snails, miracidium developed to sporocysts in 10 days, then sporocysts to redia from 4- 28 days and the final stage in snail from redia to cercaria took from 12-28 days. After 42 days, cercaria were emerged from snails and were into the water, after 1-2 hours cercaria loose their tails and encysted as metacercaria (infective larva). Fasciola gigantica was developed into adult liver fluke in bile ducts and liver of cattle (host) and laid eggs and excreted into the evironment after 111-115 days infection. Fasciola gigantica infected cattle had some clinical symptoms such as emaciation, reduced rumination, diarrhea alternating with constipation, anorexia, pale mucous membrane, bad hair condition, deep orbits and rheum. The gross lesions in infected cattle were recorded as liver inflammation and cirrhosis, encapsulated immature Fasciola destroyed the liver tissues causing hemorrhage, brown round neoplasm in liver surface, the infected livers having ivory-white yellow or clay-colored. The bill ducts were enlarged thick and fibrosis wall, the surface of bill ducts having red dots and turbid, yellowish exudation, calcified accumulation inside the bill ducts and thick cholangioles. Histopathological of liver Fasciolosis illustrated that the migration of juvenile liver flukes damaged and digested liver parenchyma and calcified and hyperplasia of bile duct epithelium, causing of compression neighbor interlobulars. Hemorrhage, congestion, and necrotic in liver parenchyma, yellowish liver and some purulent in liver, and the increasing of fibroplasia resulting in small liver lobe atrophy were observed in histophathological specimens. Albendazole (15mg/kg) and triclabendazole (20mg/kg) with an oral single dose were both effective up to 100% in eliminating Fasciola. These drugs were found safety and no adverse effects noticed during the treatment. Key words: Cattle, Mekong Delta, Fasciola, infection rate VI
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nghiên cứu sinh Hà Huỳnh Hồng Vũ với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Hữu Hưng. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây. Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án PGS.TS Nguyễn Hữu Hưng Hà Huỳnh Hồng Vũ VII
MỤC LỤC Nội dung Trang Trang phụ bìa Lời cảm tạ i Tóm lƣợc iii Abstract v Lời cam đoan vii Mục lục viii Danh sách bảng xii Danh sách hình xiv Danh sách chữ viết tắt xvi Chƣơng 1: Giới thiệu 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học 2 1.4 Ý nghĩa thực tiễn 3 1.5 Những đóng góp mới của luận án 3 Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu 4 2.1 Bệnh sán lá gan lớn 4 2.1.1 Phân loại sinh học 4 2.1.2 Đặc điểm hình thái 4 2.1.3 Vòng đời 11 2.1.4 Triệu chứng bệnh sán lá gan ở trâu bò 13 2.1.5 Bệnh tích của trâu, bò mắc bệnh sán lá gan 14 2.1.6 Quan sát mô bệnh học gan nhiễm sán 15 2.1.7 Chẩn đoán bệnh sán lá Fasciola ở trâu bò 17 2.1.7.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học của bệnh sán lá gan bò 17 2.1.7.2 Chẩn đoán bệnh sán lá gan dựa vào triệu chứng lâm sàng 17 2.1.7.3 Chẩn đoán tìm sán lá gan lớn trên bò 18 2.1.7.4 Phương pháp chẩn đoán miễn dịch 19 2.1.8 Các phương pháp xác định loài sán lá gan lớn do Fasciola sp. 19 2.1.8.1. Phương pháp hình thái 20 2.1.8.2 Phương pháp sinh học phân tử xác định và phân biệt F. hepatica và F. gigantica 22 2.1.9 Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen nhân ITS1 của SLGL 23 VIII
2.10 Một số dược phẩm tẩy trừ sán lá gan 26 2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh sán lá gan lớn 29 2.2.1. Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn ở bò trên thế giới 29 2.2.1.1. Thiệt hại do sán lá gan lớn gây ra 29 2.2.1.2 Phân loại, phân bố và tình hình nhiễm của sán lá gan lớn ở gia súc trên thế giới 32 2.2.1.3 Vật chủ trung gian của Fasciola sp. 34 2.2.1.4 Vai trò của thực vật thủy sinh đối với sự lưu tồn và phát triển Fasciola sp. 42 2.2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu tồn và phát triển Fasciola sp. 42 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sán lá gan ở trong nước 45 2.2.2.1 Tình hình nghiên cứu xác định loài Fasciola sp. ở Việt Nam 45 2.2.2.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò tại Việt Nam 46 2.2.2.3 Vật chủ trung gian của Fasciola sp. 51 2.2.2.4 Tình hình nghiên cứu nang sán lá gan ở thực vật thủy sinh 55 2.2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu tồn và phát triển Fasciola sp. 55 Chƣơng 3: Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 58 3.1 Nội dung nghiên cứu 58 3.1.1 Xác định tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 58 3.1.2 Xác định loài sán lá gan lớn (SLGL) trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 58 3.1.3 Nghiên cứu vòng đời của sán lá gan lớn 58 3.1.4 Nghiên cứu bệnh lý lâm sàng ở bò nhiễm sán lá gan lớn 58 3.1.5 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh sán lá gan lớn trên bò 58 3.2 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 59 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 59 3.2.2 Thời gian tiến hành 59 3.2.3 Địa điểm tiến hành 59 3.3 Dụng cụ và hoá chất 59 3.4 Phương pháp nghiên cứu 60 3.4.1 Xác định tình hình nhiễm sán lá gan trên bò tại Đồng bằng sông Cửu Long 60 3.4.2 Phương pháp định danh phân loài 63 IX
3.4.2.1 Phương pháp định danh phân loại sán lá gan bằng hình thái học 63 3.4.2.2 Phương pháp định danh sán lá gan lớn bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) và giải trình tự gene 64 3.4.3. Nghiên cứu vòng đời của Fasciola sp. 68 3.4.3.1 Phương pháp định danh phân loại ốc nước ngọt 68 3.4.3.2 Theo dõi quá trình phát triển của trứng sán lá gan Fasciola sp. ở ngoài môi trường trong điều kiện thí nghiệm 70 3.4.3.3 Theo dõi thời gian sống của miracidium trong nước 71 3.4.3.4 Theo dõi quá trình phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ký chủ trung gian ốc Lymnaea spp. 72 3.4.3.5 Gây nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn cho bò 74 3.4.4. Nghiên cứu các dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích đại thể và những biến đổi vi thể trên bò nhiễm sán lá gan lớn 75 3.4.4.1 Nghiên cứu triệu chứng của bò nhiễm SLGL 75 3.4.4.2. Nghiên cứu bệnh tích đại thể và mô bệnh học gan nhiễm sán lá gan lớn 76 3.4.5. Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sán lá gan lớn bò 77 Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận 81 4.1 Kết quả tình hình nhiễm sán lá gan trên bò tại ĐBSCL 81 4.1.1 Kết quả kiểm tra phân 81 4.1.2 Kết quả mổ khám xác định tình hình nhiễm SLGL trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 94 4.2 Kết quả xác định loài sán lá gan 96 4.2.1 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phương pháp truyền thống 96 4.2.2 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phương pháp sinh học phân tử 97 4.2.2.1 Kết quả phân tích PCR-RFLP trong định danh loài sán lá gan ký lớn sinh trên bò tại Đồng Bằng Sông Cửu Long 97 4.2.2.2 Kết quả xác định trình tự đoạn gen ITS1 100 4.3 Vòng đời sán lá gan 104 4.3.1 Sự phân bố các loài ốc nước ngọt - ký chủ trung gian của sán lá F. gigantica 104 4.3.2 Sự phát triển của trứng Fasciola sp. 107 4.3.3 Thời gian sống của miracidium trong môi trường nước 110 X
4.3.4 Sự phát triển của ấu trùng sán lá gan lớn trong ký chủ trung gian ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis. 111 4.3.5 Kết quả gây nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn cho bò 115 4.3.6 Kết quả xác định loài sán lá gan của bò gây nhiễm 117 4.3.6.1 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phương pháp truyền thống 117 4.3.6.2 Kết quả phân tích PCR-RFLP trong định danh loài sán lá gan ký sinh trên bò gây nhiễm 118 4.3.6.3. Tóm tắt vòng đời của sán lá gan lớn trên bò 119 4.4 Kết quả khảo sát những biểu hiện triệu chứng bệnh của nhiễm sán lá gan lớn 121 4.5 Kết quả khảo sát những biến đổi bệnh lý của gan bò nhiễm SLGL Fasciola gigantica 122 4.5.1 Bệnh tích đại thể trên gan bò nhiễm sán lá gan lớn Fasciola giganticaqua mổ khám 122 4.5.2 Bệnh tích vi thể của gan bò nhiễm sán lá gan lớn Fasciola gigantica 126 4.6 Kết quả thử nghiệm tẩy trừ SLGL Fasciola gigantica 128 Chƣơng 5: Kết luận và Đề nghị 132 5.1 Kết luận 132 5.2 Đề nghị 133 Tài liệu tham khảo 134 Danh mục liệt kê các công trình khoa học đã công bố 161 Phụ chương 162 Phụ lục A: Bản đồ các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long 162 Phụ lục B: Bảng phân bố mẫu điều tra tại các tỉnh ĐBSCL 163 Phụ lục C: Phương pháp 164 Phụ lục D: Hình ảnh 168 Phụ lục E: Thống kê 180 XI
DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 2.1 Phân biệt trứng Fasciola sp. với trứng Paramphistomum 5 explanatum và Paramphistomum cervi 2.2 Các vị trí có sai khác về nucleotide và acid amin của SLGL Việt 24 Nam và SLGL thế giới của đoạn giao gen ITS1 2.3 Tỷ lệ nhiễm F. hepatica ở gia súc trên thế giới 32 2.4 Tỷ lệ nhiễm Fasciola gigantica ở gia súc trên thế giới 33 2.5 Vật chủ trung gian của F. hepatica trên thế giới 36 2.6 Vật chủ trung gian của F. gigantica trên thế giới 38 2.7 Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu bò tại Việt Nam 50 2.8 Tỷ lệ nhiễm ấu trùng SLGL ở Lymnaea sp. tại Việt Nam 54 3.1 Phân bố mẫu điều tra 60 3.2 phân bố mẫu khảo sát theo giống, lứa tuổi, phương thức nuôi, mùa và vùng sinh thái tại các tỉnh ĐBSCL 61 3.3 Trình tự mồi tương ứng với gene 65 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 65 3.5 Thành phần mix cho một phản ứng PCR 66 3.6 Dự đoán kiểu cắt hạn chế (restriction patterns) của các enzyme 66 cắt giới hạn Ezyme RsaI ở vùng ITS1 của sán lá gan lớn 3.7 Thành phần mix cho một phản ứng cắt enzyme 67 3.8 Các mẫu sán lá trong Ngân hàng gen cung cấp chuỗi ITS-1 sử dụng ở nghiên cứu này 67 3.9 Tổng số lượng ốc nước ngọt thu thập tại 6 tỉnh ĐBSCL 69 3.10 Bố trí thí nghiệm quá trình phát triển của trứng SLG lớn 71 3.11 Bố trí thí nghiệm thời gian sống của miracidium trong nước 72 3.12 Bố trí gây nhiễm ấu trùng sán lá gan cho ốc Lymnaea 73 3.13 Bố trí gây nhiễm sán lá gan cho bò thí nghiệm 74 3.14 Bố trí thử nghiệm albendazole tẩy trừ sán lá gan bò 77 3.15 Bố trí thử nghiệm triclabendazole tẩy trừ sán lá gan bò 78 3.16 Bố trí thử nghiệm mebendazole tẩy trừ sán lá gan bò 79 4.1 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò tại ĐBSCL 81 4.2 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo giống bò tại các tỉnh ĐBSCL 84 4.3 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo lứa tuổi bò tại các tỉnh ĐBSCL 86 4.4 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo phương thức nuôi tại các XII
tỉnh ĐBSCL 87 4.5 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo mùa tại các tỉnh ĐBSCL 89 4.6 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo vùng sinh thái ở các tỉnh ĐBSCL 92 4.7 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 94 4.8 Kích thước SLG thu thập trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 96 4.9 So sánh trình tự chuỗi nucleotide vùng ITS1 của các chủng sán lá gan ở ĐBSCL và thế giới 101 4.10 Mức độ tương đồng trình tự nucleotide của các mẫu và chủng tham khảo 103 4.11 Thành phần và sự phân bố các loài ốc nước ngọt tại các tỉnh ĐBSCL 104 4.12 Tần số xuất hiện các loài ốc nước ngọt tại các tỉnh ĐBSCL 105 4.13 Sự phát triển của trứng Fasciola sp. trong môi trường nước 107 4.14 Thời gian miracidium chết trong môi trường nước sau khi thoát ra từ trứng 111 4.15 Sự phát triển của ấu trùng SLGL trong ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis. 114 4.16 Thời gian SLGL trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng ở bò sau khi gây nhiễm 115 4.17 Kết quả mổ khám bò gây nhiễm Fasciola sp. 116 4.18 Kích thước sán lá gan lớn thu thập trên bò thí nghiệm gây nhiễm SLGL 117 4.19 Tỷ lệ bò có biểu hiện triệu chứng bệnh sán lá gan Fasciola spp. 121 4.20 Một số bệnh tích đại thể trên gan bò nhiễm sán lá gan lớn Fasciola gigantica 122 4.21 Một số bệnh tích vi thể trên gan bò nhiễm Fascioala gigantica 128 4.22 Hiệu quả của thuốc albendazole trong tẩy trừ SLGL Fasciola gigantica trên bò 129 4.23 Hiệu quả của thuốc triclabendazole trong tẩy trừ SLGL Fasciola gigantica trên bò 129 4.24 Hiệu quả của thuốc mebendazole trong tẩy trừ SLGL Fasciola gigantica trên bò 130 XIII
DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang 2.1 Trứng sán lá gan lớn 5 2.2 Miracidium của sán lá gan lớn 6 2.3 Bào ấu của sán lá gan lớn 7 2.4 Rediae của sán lá gan lớn 8 2.5 Cercariae của sán lá gan lớn 8 2.6 Nang ấu trùng sán lá gan lớn 9 2.7 Sán lá gan lớn trưởng thành 10 2.8 Vòng đời của sán lá gan lớn 12 2.9 Sơ đồ hệ gen nhân tế bào 23 3.1 Sơ đồ định danh sán lá gan trên bò 63 4.1 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò ở các tỉnh ĐBSCL 82 4.2 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo giống bò tại các tỉnh ĐBSCL 84 4.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo lứa tuổi bò tại các tỉnh ĐBSCL 86 4.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan theo phương thức nuôi tại các tỉnh ĐBSCL 88 4.5 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở bò theo mùa tại các tỉnh ĐBSCL 89 4.6 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan bò theo vùng sinh thái tại các tỉnh ĐBSCL 92 4.7 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò ở các tỉnh ĐBSCL 94 4.8 Sán lá gan lớn được đo kích thước bằng thước palmer 96 4.9 Kết quả sản phẩm điện di sản phẩm PCR 98 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP 99 4.11 Minh họa 1 phần giãn đồ giải trình tự đoạn gene ITS-1 của loài sán lá gan lớn ĐBSCL 100 4.12 Minh họa một số vị trí có sự sai khác nucleotide trên đoạn ITS1 XIV
của 12 mẫu sán la gan lớn ở ĐBSCL so với sán lá gan trên thế 101 giới 4.13 Biểu đồ tần số xuất hiện ốc nước ngọt của các tỉnh ĐBSCL 106 4.14 Các giai đoạn phát triển của trứng SLGL hình thành miracidium 108 4.15 Các giai đoạn ấu trùng SLGL phát triển trong ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis 114 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR. M: thang chuẩn 100bp 118 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP 119 4.18 Sơ đồ tóm tắt vòng đời sán lá gan lớn Fasciola gigantica trên bò 120 4.19 Gan nhạt màu – hơi vàng 124 4.20 Gan sậm màu 124 4.21 Gan sưng và xơ hóa – trên bề mặt gan có vệt xuất huyết 124 4.22 Túi mật sưng chứa đầy sán 124 4.23 Thành ống dẫn mật dày lên và tích tụ calci trong ống mât 124 4.24 Ống dẫn mật màu trắng đục nổi cộm lên 124 4.25 Sán nhiều trong ống dẫn mật 124 4.26 Gan nhiễm mỡ, sưng to 125 4.27 Các vết xuất huyết xuất hiện trên gan 125 4.28 Gan bị ứ huyết 125 4.29 Vùng hoại tử ở rìa gan 125 4.30 Gan có màu vàng 125 4.31 Trên bề mặt gan xuất hiện các nốt mủ 125 4.32 Gan hóa xơ nhẹ giữa các tiểu thùy phía trong 126 4.33 Tiểu thùy gan teo nhỏ do tăng sinh mô liên kết sợi 126 4.34 Mạch máu trong khoảng liên tiểu thùy sung huyết 127 4.35 Vách ống mật hóa xơ dày ép bể các tiểu thùy gan ở kế cận 127 4.36 Sán non cư trú trong nhu mô gan 127 4.37 Tăng sinh ống dẫn mật và hóa xơ quanh ống dẫn mật trong khoảng liên tiểu thùy 127 4.38 Vách ống dẫn mật hóa xơ thấm calci 127 XV
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh đầy đủ Nghĩa/Tên tiếng Việt ADN Acid Deoxyribo Nucleic Axít deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic Axít ribonucleic Bp Base Pairs Cặp base của chuỗi ADN BL Body length Chiều dài cơ thể BR Body roundness Chu vi cơ thể BW Body width Chiều rộng cơ thể COX1 Cytochrome c Oxidase subunit I Một gen thuộc hệ gen thể cob Cytochrome b Một gen thuộc hệ gen thể dNTP Deoxynucleoside triphosphates Đơn vị cấu tạo nên ADN ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long Enzyme linked immunosorbent Phản ứng miễn dịch gắn men ELISA assay F.gigantica Fasciola gigantica F. hepatica Fasciola hepatica ITS Internal Transcribed Spacer Đoạn giao gen Loop Mediated Isothermal Kỹ thuật khuếch đại đẳng LAMP Amplification nhiệt ADN L Lymnaea Ốc Lymnaea mm milimet Milimét Nicotinamide dehydrogenase Một gen thuộc hệ gen ty thể nad1 subunit 1 National Center for Biotechnology Trung tâm tin sinh học Quốc NCBI Information gia - Mỹ PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase Restriction Fragment Length Kỹ thuật xác định đa hình độ RFLP Polymorphism dài đoạn giới hạn SLGL Sán lá gan lớn sp. Species Số ít loài spp. Species plural Số nhiều loài WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới XVI
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Theo Tổ chức y tế Thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn (SLGL) là một trong những bệnh quan trọng được phát hiện ngày càng nhiều ở người và động vật, có hơn 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL (WHO, 2015; Amer, 2016). Bệnh SLGL ở người và động vật do hai loài Fasciola gigantica và Fasciola hepatica gây ra. Trong những năm qua các nghiên cứu về bệnh SLGL đã cho biết bệnh này nằm trong danh sách bệnh truyền lây giữa vật nuôi và người. Các bệnh do sán lá gan gây ra cần phải thông qua vật chủ trung gian là các loài ốc nước ngọt, động vật giáp xác và thực vật thủy sinh như rau muống, rau cải xoong, các loại cỏ sống dưới nước... Với đặc điểm của vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là trồng lúa và rau màu nên rất thích hợp cho ốc nước ngọt và thực vật thủy sinh phát triển. Xét điều kiện tự nhiên và vị trí địa lý thì ĐBSCL là khu vực ưu thế phát triển chăn nuôi bò nhờ tận dụng thức ăn thô xanh từ nguồn phụ phẩm – phế phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến. Tuy nhiên, phần lớn chăn nuôi tập trung ở các nông hộ với quy mô nhỏ, thức ăn tận dụng là chính, trình độ người chăn nuôi còn thấp, việc ứng dụng khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi còn hạn chế, hình thức chăn nuôi chủ yếu là bán chăn thả nên khả năng bò nhiễm giun sán rất cao. Đặc biệt, bệnh SLGL có thể lây sang người nếu người ăn phải kén sán Metacercariae. Gần đây, bệnh sán lá gan lớn trên người xảy ra ở các tỉnh miền Trung và thành phố Hồ Chí Minh ngày một gia tăng (Nguyễn Văn Đề, 2005). Tại Việt Nam, bệnh SLGL ở người có xu hướng tăng dần, từ năm 2006 đến năm 2010 có số ca mắc bệnh là 15.764 và số ca đã tăng lên trên 20.000 năm 2011. Bệnh phân bố ở 52 tỉnh thành từ Bắc đến Nam và loài gây bệnh được xác định chủ yếu là F. gigantica (Nguyễn Văn Đề và ctv., 2012). Bệnh SLGL đã được một số tác giả trong nước thực hiện nghiên cứu dưới góc độ phân tử. Bước đầu, các nghiên cứu này đã giúp xác định loài SLGL gây bệnh ở nhiều vùng khác nhau trong nước. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu phân tử về SLGL ở khu vực ĐBSCL. Theo Viện Sốt rét Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn, thì gần đây các động vật bị nhiễm SLGL được điều trị không có hiệu quả do sự gia tăng kháng 1
thuốc của loài sán đối với một số thuốc đặc hiệu (www.impe-qn.org.vn). Do đó để thiết lập một chương trình phòng chống bệnh sán lá gan cần phải nắm rõ mối tương tác giữa ký chủ và ký sinh vật như đường xâm nhập, kiểu lây truyền và tuổi cảm thụ của ký chủ. Mặt khác, chúng ta phải nắm được các yếu tố ảnh hưởng khác như thời tiết, khí hậu, đất đai, v.v... và dự báo tổn thất do sán lá gan gây ra trong khu vực. Vì vậy, để thực hiện được những mục tiêu đó, yêu cầu người làm công tác thú y phải có một số kiến thức về các lĩnh vực có liên quan như dịch tễ học, bệnh học, sinh thái môi trường, quy luật nhiễm ký sinh trùng cũng như tác hại của chúng gây ra cho cơ thể vật nuôi. Để hạn chế thiệt hại do sán lá gan gây ra thì việc nghiên cứu bệnh sán lá gan và kiểm soát bệnh là rất cần thiết. Tuy nhiên, cho tới nay hầu như chưa có một công trình nghiên cứu nào có tính tổng hợp để xác định thành phần loài, đặc điểm sinh học và sự phân bố của sán lá gan ở khu vực ĐBSCL. Do đó nghiên cứu đề tài: “MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÒ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ” là rất cần thiết nhằm làm rõ hơn một số đặc điểm hình thái, dịch tễ học, sinh học của sán lá gan trong điều kiện sinh thái ở Đồng bằng sông Cửu Long. Đồng thời cung cấp thêm tư liệu khoa học về loài Fasciola sp. ký sinh trên bò ở Đồng bằng sông Cửu Long giúp cho công tác phòng chống bệnh được hiệu quả. 1.2 Mục tiêu của đề tài Xác định được loài, sự phân bố, đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Đề xuất được biện pháp tẩy trừ bệnh sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. 1.3 Ý nghĩa khoa học Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sán lá gan lớn Fasciola gigantica trên bò: xác định tình hình nhiễm bệnh và các yếu tố liên quan đến sự phân bố của mầm bệnh. Định loài bằng hình thái học và sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự gen ITS1. Là công trình đầu tiên ở ĐBSCL nghiên cứu vòng đời SLGL trên bò, xác định thành phần ký chủ trung gian, nghiên cứu bệnh lý lâm sàng ở bò, điều trị thử nghiệm và đề ra biện pháp tẩy trừ. 2