Nghiên cứu phân lập vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pylori

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

126
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu phân lập vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pylori

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYM UREASE TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY HELICOBACTER PYLORI Đỗ Hoàng Long*; Đỗ Minh Trung* Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Ức chế enzym urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là một hướng nghiên cứu mới trong điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease. Kết quả: đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết, đạt tỷ lệ thành công 94,5%. Ba chủng H. pylori có hoạt độ urease cao được chọn và tăng sinh trong môi trường Brucella broth. Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% bão hòa. Sản phẩm thu được có hoạt tính urease và tương đối tinh khiết. Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho một băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa của urease. * Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym. HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROM CULTURE BROTH SUPERNATANT SUMMARY Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pylori infection, coping with antibiotic resistance of this bacterium. This research aims to isolate H. pylori from gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used as material for the development of antibody to urease. 17 H. pylori strains were obtained from 18 biopsy samples (94.5%). Among them, three strains which showed highest urease activity were then sub-cultured in Brucella broth. Urease was extracted from culture supernatant by precipitation with ammonium sulfate 50% saturation. The obtained product maintained urease activity and relatively pure. SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product express as a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately 60.3 kDa. * Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction. * Học viện Quân y ** Bệnh viện 103 Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/12/2013 Ngày bài báo được đăng: 18/12/2013 11 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm loét DD-TT là bệnh lý thường gặp ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tỷ lệ mắc bệnh này khá cao, 60 - 70% ở Việt Nam, còn ở các nước khác dao động từ 50 - 90%. Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét DDTT, trong đó, nguyên nhân thường nhắc đến hiện nay là do nhiễm VK Helicobacter pylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10]. Việc điều trị viêm loét DD-TT do nhiễm H. pylori rất phức tạp, vì phải sử dụng phác đồ phối hợp các thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan, giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng quy cách. Tuy nhiên, khả năng thất bại trong điều trị rất lớn, do tình trạng VK kháng kháng sinh [1, 6]. Xuất phát từ thực tế lâm sàng, nhu cầu tìm ra các thuốc mới có tác dụng ức chế hoặc ngăn ngừa nhiễm H. pylori mà không lo ngại tình trạng kháng thuốc, trong đó có phương pháp miễn dịch trị liệu thụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếp H. pylori hoặc kháng enzym urease của H. pylori, thành phần quan trọng trong quá trình sinh bệnh của H. pylori, giúp chúng né tránh, tồn tại và phát triển được trong môi trường axít của dịch dạ dày, là một việc làm triển vọng [8]. Từ đó, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK và tách chiết urease từ H. pylori làm nguyên liệu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu. 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết ổ loét DDTT qua nội soi của 18 bệnh nhân bị loét DD-TT đến khám tại phòng khám nội soi tiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011 và tháng 3 - 2012. Các hóa chất sinh phẩm: BHI (Brainheart infusion broth) (BioRad, Mỹ), Brucella broth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết thanh bào thai bê (FBS - Fetal bovine serum) (Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp) và túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp). 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Phân lập và định danh H. pylori từ bệnh phẩm: Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi được bảo quản trong ống nghiệm chứa BHI broth vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm tại Bộ môn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103. Tại đây, nghiền nát bệnh phẩm bằng dụng cụ vô trùng và nuôi cấy phân lập chọn lọc trong đĩa petri chứa môi trường Pylori agar đặt trong túi vi hiếu khí GENbag microear (5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở 37oC. VK được phân lập sau 5 ngày nuôi cấy và định danh bằng nhuộm Gram, các phản ứng sinh hóa như oxidase, catalase và urease [3, 5]. * Nuôi cấy tăng sinh H. pylori và tách chiết urease từ dịch nuôi cấy: Nuôi cấy các chủng H. pylori có hoạt tính urease mạnh nhất tăng sinh trong môi trường Brucella broth trong tủ ấm 37oC có lắc liên tục trong 72 giờ. Urease được tách chiết từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ bão hòa. Sản phẩm kết tủa được thẩm tích loại muối, xác định hoạt tính urease, xác định độ tinh sạch và kích thước. Xác định hoạt tính urease trong dịch nuôi cấy và sản phẩm sau mỗi bước tách chiết nhờ test urease theo nguyên lý urease thủy phân ure thành ammonia, tạo môi trường kiềm và chuyển chỉ thị màu đỏ phenol trong môi trường phản ứng thành màu hồng cánh sen có độ hấp phụ quang mạnh nhất ở bước sóng 340 nm. Xác định nồng độ protein enzym thu được bằng kỹ thuật Bradford. Xác định độ tinh sạch và kích thước của 13 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 sản phẩm bằng phương pháp điện di SDSPAGE 10% trong điều kiện biến tính. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Phân lập VK. Sau 5 ngày nuôi cấy, 17/18 mẫu phân lập (94,5%) (trừ mẫu số 10) có VK mọc với hình ảnh khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám trong, đường kính 0,5 - 1 mm. Kết quả nhuộm Gram và các phản ứng sinh hóa cho thấy cả 17 chủng phân lập đều cho kết quả nhuộm Gram (-) và hình thể đa số là hình cong, mức độ xoắn nhẹ, không điển hình. Kết quả các phản ứng sinh hóa để định danh H. pylori gồm urease, oxydase và catalase đều cho kết quả dương tính. Bảng 1: Kết quả nuôi cấy phân lập và định danh VK. PHẢN ỨNG SINH HÓA MÃ SỐ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 01 02 03 + + + NHUỘM GRAM Urease Oxydase Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 08 + + + + + 09 + + + + + 10 - 11 + + + + + 12 + + + + + 13 + + + + + 14 + + + + + 15 + + + + + 16 + + + + + 17 + + + + + 18 + + + + + H. pylori là một trong những VK rất khó phân lập và chỉ mọc ở những môi trường chuyên biệt với điều kiện thích hợp. Pylori agar và túi ủ GENbag microear (5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở 37oC được xác định là thích hợp cho chúng tăng sinh theo khuyến cáo của nhiều tác giả [5]. Đó có thể là lý do giải thích tại sao tỷ lệ phân lập H. pylori của chúng tôi đạt được 94,5%, cao hơn các tác giả khác trong nước (47 - 56,4%) [1]. 2. Tách chiết urease. 0.7 OD (340 nm) Hình 1: Khuẩn lạc thu được khi nuôi cấy trong môi trường vi hiếu khí. 04 05 06 07 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 11 12 13 14 15 16 17 18 Chñng vi khuÈn Helicobacter pylori Hình 2: Kết quả phản ứng urease của các chủng H.pylori thu được. 14 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Kết quả phân tích hoạt tính urease trong dịch nổi của 17 chủng VK nghiên cứu nhận thấy 3 chủng H. pylori (HP13, HP16 và HP18) có hoạt tính cao hơn và hoạt tính này còn cao hơn nữa sau khi cho tăng sinh lần 1 (sau 24 giờ), lần 2 (qua đêm) và lần 3 (sau 48 giờ) của cả 3 chủng H. pylori này [4, 8]. Ba chủng HP13, HP16 và HP18 được lựa chọn để nuôi cấy tăng sinh và phân lập urease tiểu đơn vị. Tuy nhiên, kết quả thu được chỉ gần giống nhau chứ không trùng khớp với nhau hoàn toàn, mặc dù cùng chung một phương pháp xác định. Điều này chứng tỏ urease từ các chủng khác nhau của H. pylori có một số khác biệt về phân tử lượng từng chuỗi tiểu đơn vị. Trong nghiên cứu này, trên băng điện di của ba chủng VK H. pylori cũng chỉ có một vạch sáng nhất, tương đương nhau và tương ứng về lý thuyết với kích thước của tiểu đơn vị B trong phân tử urease. Tại Việt Nam, mới chỉ có nghiên cứu tách chiết, tinh sạch urease từ thực vật và hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu về urease của VK H. pylori [2]. KẾT LUẬN Hình 3: Điện di SDS-PAGE 10%. M: protein chuẩn; HP13, PH16, HP18 là sản phẩm kết tủa của các chủng tương ứng. Bằng phương pháp kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy các chủng HP13, HP16 và HP18 với ammonium sulfate 50% thu được lượng protein có hoạt tính urease lần lượt là 1,78 mg/ml, 1,95 mg/ml và 1,71 mg/ml. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm thu được sau kết tủa và thẩm tích tương đối thuần nhất, trong đó, băng đậm nhất có kích thước khoảng 60,3 kDa. Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về enzym urease của H. pylori và các đặc tính của chúng về phân tử lượng của chuỗi Đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT. Đã tách chiết được enzym urease từ dịch nuôi cấy của 3 chủng sinh urease với hoạt tính cao nhất; sản phẩm thu được còn giữ được hoạt tính urease đặc trưng, tương đối tinh khiết, có thể sử dụng làm nguyên liệu gây miễn dịch tạo kháng thể kháng urease. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai. Tính đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori trong bệnh viêm loét DD-TT. Y học Thành phố Hồ Chí Minh. 2006, 10 (1), tr.73-75. 2. Lê Thị Phú & Nguyễn Thị Cẩm Vi. Xác định phân tử lượng và các thông số động học của urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam. Tạp chí Phát triển KH & CN. 2007, 10 (5), tr.41-50. 15 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 3. Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thái Sơn. Helicobacter pylori và bệnh viêm, loét DD-TT. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2003, tr.7-104. 4. Icatlo FC, Kuroki M, Kobayashi C, Yokoyama H, Ikemori Y, Hashi T et al. Affinity purification of Helicobacter pylori urease. J Biol Chem. 1998, 273 (29), pp.18130-18138. 5. Kusters JG, van Vliet AHM & Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clin Microbiol Rev. 2006, 19 (3), pp.449-490. 6. Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain CA, Atherton J, Axon AT, Bazzoli F et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/Florence Consensus Report. Gut. 2012, 61 (5), pp.646-664. 7. Mobley HLT, Island MD & Hausinger RP. Molecular biology of microbial ureases. Microbiol Rev. 1995, 59 (3), pp.451-480. 8. Suzuki H, Nomura S, Masaoka T, Goshima H, Kamata N, Kodama Y, et al. Effect of dietary anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin Y on Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther. 2004, 20 (1), pp.185-192. 9. Turbett GR, Høj PB, Horne R & Mee BJ. Purification and characterization of the urease enzymes of Helicobacter species from humans and animals. Infect Immun. 1992, 60 (12), pp.5259-5266. 10. Versalovic J. Helicobacter pylori: pathology and diagnostic strategies. Am J Clin Pathol. 2003, 119, pp.403-412. 16