Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> PHÁT HIỆN CÁC ĐIỂM ĐỘT BIẾN TRÊN GEN GYRA VÀ PARC<br /> CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU PHÂN LẬP<br /> Lê Văn Hưng<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết.<br /> Tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết<br /> dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với<br /> kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả cho thấy các chủng nhạy cảm có nồng độ ức chế tối thiểu<br /> (Minimum Inhibitory Concentratation - MIC) 0,002 - 0,060 µg/ml không có đột biến gen. Các chủng có MIC<br /> càng cao càng xuất hiện nhiều đột biến trên gen gyrA và parC. Trên gen gyrA: 100% số chủng có đột biến<br /> tại codon 91 (Ser thành Phe). 63,8% số chủng có đột biến tại codon 95 (Asp thành Ala), các đột biến ở vị trí<br /> khác có tần số thấp hơn. Trên gen parC: 44,9% số chủng có đột biến tại codon 87 (Ser thành Asn). Đột biến<br /> ở codon 86 và 91 xuất hiện với tần số thấp hơn.<br /> Từ khóa: vi khuẩn lậu, kháng kháng sinh, ciprofloxacin, đột biến gen<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ciprofloxacin là một kháng sinh được chỉ<br /> định điều trị bệnh lậu với liều uống duy nhất<br /> (500 mg), vì vậy kháng sinh này được thầy<br /> thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng. Do đó,<br /> việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc<br /> độ đề kháng đang tăng nhanh và nếu không<br /> có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin<br /> có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng<br /> đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới. Nhiều<br /> nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới<br /> như Trees D. L và cộng sự (1998) tại Trung<br /> tâm phòng chống bệnh xã hội Atlanta, Mỹ [1],<br /> Su X. và Lind I. (2001) tại Đan Mạch [2]... về<br /> những chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin<br /> cho thấy: những chủng đề kháng với<br /> ciprofloxacin đều có những thay đổi trên gen<br /> gyrA và gen parC. Đó là các gen có liên quan<br /> đến kháng ciprofloxacin. Gen gyrA có độ dài<br /> Địa chỉ liên hệ: Lê Văn Hưng - Bộ môn Da liễu - Trường<br /> Đại học Y Hà Nội<br /> Email: levanhungvdl@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 26/03/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 20/6/2013<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 2.751 nucleotide, mã hoá 916 amino acid;<br /> vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng<br /> 279 nucleotide, mã hoá 93 amino acid. Gen<br /> parC có độ dài 2.307 nucleotide, mã hoá 768<br /> amino acid; vùng quyết định đề kháng<br /> quinolon dài khoảng 255 nucleotide, mã hoá<br /> 85 amino acid. Những nghiên cứu về tình hình<br /> kháng kháng sinh, cơ chế đề kháng của vi<br /> khuẩn lậu là rất cần thiết và phải được tiến<br /> hành thường xuyên nhằm đóng góp hữu hiệu<br /> cho công tác phòng chống các bệnh lây truyền<br /> qua đường tình dục nói chung và bệnh lậu nói<br /> riêng. Xuất phát từ những lý do trên đề tài<br /> nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu:<br /> góp phần tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng<br /> sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> Trong khoảng thời gian từ năm 2005 đến<br /> 2007, có 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết<br /> dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại bệnh viện<br /> Da liễu Trung ương, phân lập được 503<br /> chủng. Nghiên cứu này đã chọn ngẫu nhiên 6<br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> tháng từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm<br /> <br /> 3. Phương pháp<br /> <br /> 2007 được 71 chủng vi khuẩn lậu.<br /> <br /> 3.1. Kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu<br /> <br /> 2. Vật liệu<br /> <br /> Nhuộm Gram →Nuôi cấy trên môi trường<br /> <br /> Tủ nuôi cấy CO2 Sanyo (Nhật Bản). Môi<br /> <br /> Thayer - Martin →Test Oxidase và Neisseria 4H<br /> <br /> trường Thayer - Martin, Neisseria 4H, Oxidase<br /> <br /> → Kết luận: Neisseria gonorrhoear → Tiến<br /> hành kỹ thuật kháng sinh đồ: sử dụng E - test<br /> để xác định MIC của vi khuẩn lậu.<br /> <br /> (Mỹ). Thanh giấy E - test (Thụy Điển). Chủng<br /> chuẩn: ATCC 49226 (WHO cung cấp) (bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Các đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR và giải mã trình tự gen [3]<br /> <br /> Trình tự mồi (5’ - 3’)<br /> <br /> Gen<br /> <br /> Kích thước đoạn gen<br /> được khuếch đại<br /> <br /> Mồi xuôi<br /> Mồi ngược<br /> <br /> CGGCGCGTACTGTACGCGATGCA<br /> AATGTCTGCCAGCATTTCATGTGAGA<br /> <br /> GyrA<br /> <br /> 279bp<br /> <br /> Mồi xuôi<br /> Mồi ngược<br /> <br /> ATGCGCGATATGGGTTTGAC<br /> GGACAACAGCAATTCCGCAA<br /> <br /> ParC<br /> <br /> 255bp<br /> <br /> Thiết kế<br /> <br /> 3.2. Quy trình PCR đối với gen gyrA và<br /> gen parC<br /> Sử dụng hóa chất của hãng Bio - rad (Hoa<br /> Kỳ) với 2 cặp mồi đặc hiệu để tiến hành quy<br /> trình PCR đối với gen gyrA và gen parC.<br /> Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 10x<br /> (5 ml); dNTP 10 mM (1 ml); MgCl2 50 mM (1,5<br /> <br /> 3.3. Quy trình giải trình tự gen<br /> Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể<br /> chứa đột biến được thực hiện theo quy trình<br /> hướng dẫn của hãng.<br /> a. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute<br /> PCR Purification Kit:<br /> Thêm 200 ml buffer PB vào 40 ml sản<br /> <br /> ml); Taq polymerase 5 UI/ml (0,5 ml); Dung<br /> dịch DNA (5 ml); Mồi xuôi 10 mM (2,5 ml); Mồi<br /> <br /> phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. Cho toàn bộ<br /> <br /> ngược 10 mM (2,5 ml); Nước khử ion (32 ml).<br /> Tổng thể tích là 50 ml.<br /> <br /> dịch vào cột chiết tách. Ly tâm 13.000 vòng/<br /> phút trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch lọc. Thêm<br /> <br /> - Chu kỳ nhiệt:<br /> 93oC 3 phút - [93oC 30 giây - 52oC 1 phút 72 C 1 phút] x 30 chu kì - 72oC 5 phút.<br /> o<br /> <br /> - Sản phẩm khuếch đại gen<br /> Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose<br /> <br /> 750 ml buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút<br /> trong 1 phút. Hút bỏ dịch lọc. Ly tâm thêm<br /> 20.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột<br /> chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 20 ml<br /> buffer EB vào chính giữa cột chiết tách. Để ở<br /> <br /> 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch<br /> sau khi chạy điện di được ngâm trong dung<br /> <br /> nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 10.000<br /> vòng/phút. Bảo quản ở -20oC.<br /> <br /> dịch ethidium bromid 0,5 mg/ml trong 30 phút,<br /> <br /> b. Phản ứng giải trình tự (Sequencing<br /> Reaction).<br /> <br /> rửa qua nước cất. Chụp ảnh bản gel trong<br /> buồng tối dưới ánh sáng cực tím. Sản phẩm<br /> PCR được dùng để giải trình tự.<br /> 36<br /> <br /> Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen gyrA và<br /> gen parC.<br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing<br /> <br /> Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ<br /> <br /> Core Kit: Pha Premix gồm 5X sequencing<br /> buffer (4 ml); dNTP mix (1 ml); A dye<br /> <br /> dịch nổi. Thêm 200 ml cồn 70%. Ly tâm<br /> 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch<br /> <br /> terminator (0,5 ml); C dye terminator (0,5 ml);<br /> G dye terminator (0,5 ml); T dye terminator<br /> <br /> nổi. Để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.<br /> Hoà tan bằng 25 ml final buffer.<br /> <br /> (0,5 ml); AmpliTaq (1 ml).<br /> Thành phần phản ứng: Premix 8µl, sản<br /> phẩm PCR sau tinh sạch 5µl, mồi 3,2 pmol,<br /> nước cất vừa đủ 20µl.<br /> Chu kỳ nhiệt:<br /> 96oC 10 giây – [96oC 10 giây – 50oC 5 giây<br /> – 60oC 4 phút] x 25 chu kỳ - 4oC 1 phút<br /> c. Tinh sạch sản phẩm<br /> <br /> - Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310<br /> của hãng Applied Biosystem.<br /> Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên<br /> cứu được so sánh với trình tự nucleotide của<br /> gen gyrA và parC của chủng vi khuẩn lậu gốc<br /> để tìm ra các điểm khác nhau với chủng gốc.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> Thêm vào 20 ml sản phẩm sequencing: 3<br /> ml KCH3COO 3M pH = 7,0; 14,5 µl nước cất;<br /> 62,5 µl cồn 100%. Để nhiệt độ phòng 15 phút.<br /> <br /> 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác<br /> định đoạn gen gyrA, parC<br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> <br /> xác định đoạn gen gyrA<br /> Giếng 1: chứng âm<br /> <br /> xác định đoạn gen ParC<br /> Giếng 1: chứng âm<br /> <br /> Giếng 2: chứng dương<br /> Giếng 3: thang ADN 100 bp<br /> <br /> Giếng 2: chứng dương<br /> Giếng 3: thang ADN 100 bp<br /> <br /> Giếng 4 đến 7: kết quả dương tính<br /> <br /> Giếng 4 đến 7: kết quả dương tính<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 37<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2. Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)<br /> <br /> 3. Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> <br /> vậy, MIC cũng có mối liên quan với số lượng<br /> <br /> vi khuẩn lậu gồm: 2 chủng nhạy cảm và 69<br /> <br /> đột biến [4]. Với MIC nhỏ, mang ít đột biến.<br /> MIC lớn mang nhiều đột biến hơn. Kết quả<br /> <br /> chủng đề kháng. Phân tích các đột biến trên<br /> gen gyrA và parC và sự phối hợp giữa các đột<br /> <br /> này tương đồng với những nghiên cứu của<br /> các tác giả trên thế giới [5, 6, 7]. Tuy nhiên,<br /> <br /> biến trên 2 gen này cho thấy: tất cả những<br /> chủng đề kháng đều có đột biến trên 2 gen<br /> <br /> nghiên cứu này thu được kết quả khác với các<br /> tác giả các tác giả trên thế giới là những<br /> <br /> gyrA và parC, số lượng đột biến cũng tăng<br /> theo nồng độ MIC. 2 chủng nhạy cảm MIC<br /> <br /> chủng kháng ciprofloxacin đều có đột biến trên<br /> <br /> Nghiên cứu giải trình tự gen của 71 chủng<br /> <br /> 0,002 - 0,060 µg/ml (2,8%) không có thay đổi<br /> <br /> gen gyrA tại codon 91 (Ser thành Phe). Điều<br /> này có thể do những chủng vi khuẩn lậu lây<br /> <br /> nào trong trình tự DNA. 11 chủng đề kháng có<br /> MIC 1 - 2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến<br /> <br /> truyền hiện nay tại Việt Nam có nguồn gốc từ<br /> cùng một chủng và mang tính khu vực [8]. Kết<br /> <br /> trên gen gyrA và không mang đột biến trên<br /> gen parC. 6 chủng đề kháng có MIC 1 - 2 µg/<br /> <br /> quả của nghiên cứu thu được đã chứng minh<br /> rằng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với<br /> <br /> ml (8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA<br /> <br /> ciprofloxacin, loại thuốc được xem như liệu<br /> <br /> và parC; 52 chủng đề kháng có MIC 3 - 32 µg/<br /> ml (73,2%) mang 3 đột biến gồm 2 đột biến ở<br /> <br /> pháp hàng đầu vào những năm 1990, đã tăng<br /> lên nhanh chóng ở mức MIC cao đáng báo<br /> <br /> codon 91 (Ser thành Phe) và codon 95 (Asp<br /> thành Ala) của gen gyrA, và 1 đột biến ở<br /> <br /> động với các đột biến mới ở vi khuẩn lậu. Do<br /> đó sự giám sát liên tục về tính kháng kháng<br /> <br /> codon 87 (Ser thành Asn) của gen parC. Như<br /> <br /> sinh, với khuynh hướng ngày càng gia tăng<br /> <br /> 38<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> những chủng đa đề kháng lan truyền trong<br /> cộng đồng là rất cần thiết để có thể tránh<br /> những thất bại trong điều trị.<br /> <br /> 3. Otero, L., et al (2001). First Isolate of a<br /> Neisseria gonorrhoeae Strain<br /> <br /> Associated<br /> <br /> With an Ofloxacin Treatment Failure in Spain.<br /> Sex Transm Dis, 28(10), 576 - 578.<br /> <br /> V. KẾT LUẬN<br /> <br /> 4. Xu J. S., Wang B., Wang C. X., et al<br /> <br /> Ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon. Đích<br /> <br /> (2006). Study on fluoroquinolone<br /> <br /> resistance<br /> <br /> tác động của nhóm kháng sinh này là ADN<br /> gyrase và topoisomerase IV của vi khuẩn. Sự<br /> <br /> and the relationship between resistance and<br /> <br /> đột biến của vi khuẩn lậu (tại gen gyrA và<br /> parC làm thay đổi đích kháng sinh, do đó dẫn<br /> <br /> orrhoeae. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi,<br /> <br /> đến sự đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin<br /> của vi khuẩn lậu.<br /> <br /> 5. Shultz T. R., Tapsall J. W., White P. A.<br /> (2001). Correlation of in vitro susceptibilities to<br /> <br /> Lời cảm ơn<br /> <br /> newer quinolones of naturally occurring quino-<br /> <br /> Xin cảm ơn sự giúp đỡ chân thành từ<br /> PGS.TS. Trần Hậu Khang, ThS. Trần Mẫn<br /> Chu, ThS. Phạm Đăng Bảng, PGS.TS.<br /> Nguyễn Vũ Trung, CN. Ninh Thị Dần, CN. Lê<br /> Phương Thảo bệnh viện Da liễu Trung ương<br /> và GS.TS. Norihisa Ishii, Viện truyền nhiễm<br /> quốc gia, Nhật Bản.<br /> <br /> mutations of gyrA and parC in Neisseria gon27(8), 702 - 704.<br /> <br /> lone-resistant Neisseria gonorrhoeae strains<br /> with changes in gyrA and parC. Antimicrob<br /> Agents Chemother, 45(3), 734 - 738.<br /> 6. Tanaka M., Nakayama H., Haraoka M.,<br /> et al (2000). Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and high prevalence of<br /> ciprofloxacin-resistant solates in Japan, 1993<br /> to 1998. J Clin Microbiol, 38(2), 521 - 525.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 7. Zhang T., Zhou X., Chen Y., et al.<br /> <br /> 1. Trees D. L., Sandul A. L., Whittington<br /> W. L et al (1998). Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacinresistant isolates of Neisseria gonorrhoeae. Anti-<br /> <br /> (2009). Fluoroquinolone resistance and mutation patterns in gyrA and parC genes in<br /> Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai, China. J Huazhong Univ Sci Technolog<br /> <br /> microb Agents Chemother, 42(8), 2103 - 2105.<br /> 2. Su X., Lind I (2001). Molecular basis of<br /> high - level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Denmark<br /> <br /> Med Sci, 29(1), 29 - 34.<br /> <br /> from<br /> <br /> Neisseria<br /> <br /> 1995<br /> <br /> to<br /> <br /> 1998.<br /> <br /> Antimicrob<br /> <br /> Chemother, 45(1), 117 - 123.<br /> <br /> Agents<br /> <br /> 8. Chaudhry U., Ray K., Bala M., et al<br /> (2002). Mutation patterns in gyrA and parC<br /> genes of ciprofloxacin resistant isolates of<br /> gonorrhoeae<br /> <br /> from<br /> <br /> India.<br /> <br /> Sex<br /> <br /> Transm Infect, 78(6), 440 - 444.<br /> <br /> Summary<br /> MUTATIONS IN GYRA AND PARC GENES OF<br /> NEISSERIA GONORRHOEAE ISOLATED FROM PATIENTS<br /> We study the antibiotic resistance and resistance mechanisms of N. gonorrhoeae. We<br /> sequenced a part of gyrA and parC genes of 71 strains from patients admitted at the National<br /> Hospital for Dermatology and Venereology with urethral and vaginal discharges to understand the<br /> resistance mechanisms to ciprofloxacin. Ciprofloxacin-susceptible strains (MIC 0,002-0,060 µg/<br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 39<br /> <br />