T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br />
<br />
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br />
BẰNG ĐỊNH LƯỢNG DICLOFENAC TRONG<br />
DỊCH TIỀN PHÒNG MẮT THỎ<br />
Đặng Thị Hiền*; Quản Duy Quang*; Nguyễn Hải Trường*<br />
Nguyễn Văn Long*; Nguyễn Trần Linh*<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng dược chất diclofenac<br />
có trong dịch tiền phòng mắt thỏ. Đối tượng và phương pháp: dược chất diclofenac có trong<br />
dịch tiền phòng của mắt thỏ. Kết quả: thời gian lưu của diclofenac khoảng 7,1 phút, tính chọn<br />
lọc, độ chính xác, độ đúng và tỷ lệ thu hồi, đường chuẩn, độ tái lặp và độ ổn định đều được<br />
thẩm định. Khoảng tuyến tính và giới hạn định lượng của diclofenac lần lượt 500 - 8.000 ng/ml<br />
và 500 ng/ml. Kết luận: phương pháp đã xây dựng đạt mọi yêu cầu của FDA về phân tích trong<br />
dịch sinh học.<br />
* Từ khóa: Diclofenac; Dịch tiền phòng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br />
<br />
Determination of Diclofenac in Rabit Aqueous Humor by High<br />
Performance Liqid Chromatography<br />
Summary<br />
Objectives: Validation of a HPLC method for the determination of diclofenac in rabbit aqueous<br />
humor. Subjects and methods: Diclofenac in rabbit aqueous humor. Results: The retention time<br />
was about 7.1 min for diclofenac. The selectivity, accuracy, precision, calibration curve, and<br />
stability had been validated. The linear range and lower limit of quantification for diclofenac were<br />
500 - 8,000 ng/ml and 500 ng/ml, respectively. Conclusions: Construction method has achieved<br />
requirements of the FDA for analysis in biological fluids.<br />
* Key words: Diclofenac; Aqueous humor; High performance liquid chromatography.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Diclofenac là dẫn chất của axít phenylacetic<br />
thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid,<br />
ức chế chọn lọc COX - 2 hơn COX - 1, có<br />
tác dụng chống viêm, giảm đau và hạ sốt<br />
mạnh. Diclofenac dùng cho mắt trên thị<br />
trường mới chỉ có ở dạng dung dịch với<br />
nồng độ 0,1%, thuốc tác dụng rất ngắn.<br />
Vì vậy, bệnh nhân phải nhỏ thuốc ít nhất<br />
<br />
3 - 5 lần/ngày cho mỗi chỉ định điều trị [4].<br />
Nano nhũ tương là một hệ cấp thuốc mới,<br />
được chứng minh rất thích hợp dùng cho<br />
mắt [8]. Bộ môn Bào chế, Đại học Dược<br />
Hà Nội đã có nhiều nghiên cứu về xây<br />
dựng công thức và quy trình bào chế dạng<br />
nhũ tương nano nhỏ mắt chứa diclofenac<br />
[1, 2, 3]. Tuy nhiên, để có thể ứng dụng<br />
vào thực tế, cần nghiên cứu sinh dược<br />
học và dược động học của chế phẩm này.<br />
<br />
* Đại học Dược Hà Nội<br />
Người phản hồi (Corresponding): Đặng Thị Hiền (hiendang171084@gmail.com)<br />
Ngày nhận bài: 30/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/09/2016<br />
Ngày bài báo được đăng: 15/09/2016<br />
<br />
102<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br />
Các phương pháp định lượng HPLC detector DAD, HPLC - detector FLD [6],<br />
HPLC - MS [7] được sử dụng để định lượng<br />
dược chất trong dịch tiền phòng mắt thỏ.<br />
Tuy nhiên, để có thể áp dụng và đảm bảo<br />
tính tin cậy, bất kỳ một phương pháp phân<br />
tích nào cũng cần được thẩm định. Trong<br />
giới hạn cho phép của đề tài với các trang<br />
thiết bị, nguyên vật liệu hiện có, việc thẩm<br />
định phương pháp định lượng diclofenac<br />
có trong dịch tiền phòng mắt thỏ bằng<br />
phương pháp HPLC - detector DAD được<br />
thực hiện theo các số tiêu chí của FDA [5].<br />
ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG<br />
PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tượng nghiên cứu.<br />
Dược chất (axít diclofenac: AD) có trong<br />
dịch tiền phòng mắt thỏ được định lượng<br />
bằng phương pháp HPLC với detector mảng<br />
diod (DAD) [1, 2, 3].<br />
Mẫu chuẩn: cân chính xác 0,01 g AD<br />
vào bình định mức 10 ml, thêm methanol,<br />
lắc đều cho tan. Bổ sung methanol vừa<br />
đủ đến vạch. Pha loãng bằng methanol và<br />
trộn đồng lượng với dịch tiền phòng trắng<br />
để thu được nồng độ chuẩn cần phân tích.<br />
Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong<br />
10 phút. Lấy dịch trong.<br />
2. Thiết bị.<br />
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent<br />
1260 Infinite (Mỹ), máy ly tâm lạnh Universal<br />
320R (Anh), máy lắc xoáy Vortex, cân phân<br />
tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ khác…<br />
3. Phương pháp nghiên cứu.<br />
* Phương pháp định lượng:<br />
- Điều kiện:<br />
+ Pha tĩnh: cột C8 kích thước 150 mm ×<br />
4,6 mm (Octyl silica gel 5 µm).<br />
<br />
+ Pha động: hỗn hợp methanol và dung<br />
dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 75/25,<br />
lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm,<br />
siêu âm 15 phút.<br />
+ Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút.<br />
+ Thể tích tiêm mẫu: 50 µl.<br />
+ Detector UV bước sóng: 276 nm.<br />
* Động vật thí nghiệm:<br />
Thỏ đực giống, cân nặng khoảng 2,5 3,0 kg, đảm bảo tiêu chuẩn động vật thí<br />
nghiệm, do Trung tâm CIMADE cung cấp<br />
và chăm sóc. Tại thời điểm tiến hành thí<br />
nghiệm, không có bất cứ dấu hiệu bất<br />
thường nào trên mắt.<br />
* Thẩm định phương pháp định lượng<br />
diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ:<br />
Quy trình thẩm định phương pháp định<br />
lượng tiến hành theo hướng dẫn của FDA<br />
[5].<br />
- Tính chọn lọc: chuẩn bị 6 mẫu dịch tiền<br />
phòng trắng từ 6 thỏ khác nhau. Chuẩn bị<br />
6 mẫu dịch tiền phòng chứa AD ở nồng<br />
độ giới hạn định lượng dưới (LLOQ) dự<br />
kiến khoảng 500 ng/ml. Phân tích các mẫu<br />
bằng phương pháp HPLC.<br />
- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:<br />
+ Chuẩn bị mẫu dịch tiền phòng chứa AD<br />
với 8 nồng độ chính xác (500, 1.000, 1.500,<br />
2.000, 3.000, 4.000, 6.000 và 8.000 ng/ml),<br />
mỗi nồng độ 2 mẫu độc lập (có điều chỉnh<br />
khối lượng AD cân). Phân tích các mẫu<br />
bằng phương pháp HPLC.<br />
+ Xây dựng đường chuẩn theo mô hình<br />
hồi quy tuyến tính.<br />
- Giới hạn định lượng dưới:<br />
+ Chuẩn bị 6 mẫu dịch tiền phòng<br />
chứa AD ở nồng độ chính xác (500 ng/ml)<br />
(có điều chỉnh khối lượng AD cân). Chuẩn<br />
bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện.<br />
103<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br />
+ Phân tích các mẫu bằng phương pháp<br />
HPLC.<br />
<br />
được của mẫu kiểm tra so với nồng độ<br />
thực đã pha.<br />
<br />
+ Xác định độ đúng bằng cách so sánh<br />
nồng độ tính được từ đường chuẩn với<br />
nồng độ thực đã pha. Xác định độ chính<br />
xác bằng cách tính độ lệch chuẩn tương<br />
đối RSD.<br />
<br />
+ Xác định độ lặp lại trong ngày bằng<br />
cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD<br />
giữa các giá trị phân tích được của mỗi<br />
nồng độ. Xác định độ lặp khác ngày bằng<br />
cách lặp lại các bước trên trong 3 ngày.<br />
Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giữa<br />
giá trị phân tích được của mỗi nồng độ<br />
trong những ngày đánh giá.<br />
<br />
- Độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại trong<br />
ngày và khác ngày):<br />
+ Chuẩn bị 3 lô mẫu dịch tiền phòng<br />
chứa AD, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập: mẫu<br />
kiểm tra nồng độ thấp (LQC): khoảng<br />
1.000 ng/ml. Mẫu kiểm tra nồng độ trung<br />
bình (MQC) khoảng 3.500 ng/ml. Mẫu kiểm<br />
tra nồng độ cao (HQC) khoảng 6.500 ng/ml.<br />
+ Chuẩn bị một đường chuẩn trong<br />
cùng điều kiện.<br />
+ Phân tích các mẫu bằng phương<br />
pháp HPLC.<br />
+ Xác định độ đúng của phương pháp<br />
bằng cách so sánh nồng độ phân tích<br />
<br />
- Độ ổn định:<br />
+ Chuẩn bị 2 lô mẫu dịch tiền phòng<br />
chứa AD, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập: mẫu<br />
kiểm tra LQC khoảng 1.000 ng/ml. Mẫu<br />
kiểm tra HQC khoảng 6.500 ng/ml.<br />
+ Phân tích ngay các mẫu bằng phương<br />
pháp HPLC, xác định hàm lượng dược<br />
chất trong mẫu ban đầu.<br />
+ Sau 24 giờ, phân tích lại các mẫu<br />
bằng phương pháp HPLC, xác định lại<br />
hàm lượng dược chất trong các mẫu trên.<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br />
1. Kết quả thẩm định tính chọn lọc.<br />
<br />
mAU<br />
<br />
mAU<br />
<br />
Diclofenac<br />
<br />
min<br />
<br />
Hình 1: Sắc ký đồ của dịch tiền phòng trắng.<br />
<br />
Diclofenac<br />
<br />
min<br />
<br />
Hình 2: Sắc ký đồ của dịch tiền phòng<br />
có chứa diclofenac 500 ng/ml.<br />
<br />
Kết quả trên sắc ký đồ (n = 6) cho thấy, tại thời điểm khoảng 7,1 phút, các mẫu trắng<br />
không xuất hiện píc, các mẫu thử đều xuất hiện píc được tách riêng, đó là píc của diclofenac.<br />
Như vậy, phương pháp định lượng có tính chọn lọc cao.<br />
104<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br />
<br />
Diện tích peak (m AU.s)<br />
<br />
2. Kết quả thẩm định tính tuyến tính.<br />
1200<br />
y = 0.116x + 15.758<br />
2<br />
R = 0.9956<br />
<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
0<br />
<br />
2000<br />
<br />
4000<br />
6000<br />
Nồng độ dung dịch (ng/ml)<br />
<br />
8000<br />
<br />
10000<br />
<br />
Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ diclofenac trong<br />
dịch tiền phòng và diện tích píc.<br />
Bảng 1: Tương quan giữa nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng và diện tích píc.<br />
STT<br />
<br />
Nồng độ AD (ng/ml)<br />
<br />
Diện tích píc (mAU.s)<br />
<br />
1<br />
<br />
516,3<br />
<br />
77,1<br />
<br />
2<br />
<br />
1032,5<br />
<br />
119,8<br />
<br />
3<br />
<br />
1425,0<br />
<br />
195,9<br />
<br />
4<br />
<br />
2065,0<br />
<br />
236,6<br />
<br />
5<br />
<br />
2850,0<br />
<br />
372,8<br />
<br />
6<br />
<br />
4100,0<br />
<br />
469,2<br />
<br />
7<br />
<br />
5700,0<br />
<br />
704,4<br />
<br />
8<br />
<br />
8200,0<br />
<br />
954,5<br />
<br />
Kết quả thống kê<br />
<br />
Phương trình hồi quy:<br />
y = 0,116x + 15,75<br />
2<br />
R = 0,995<br />
<br />
Tính lại nồng độ hoạt chất có trong mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy đã xây<br />
dựng. Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, 100% số điểm đạt được độ<br />
đúng so với giá trị thực nằm ở giới hạn cho phép (85 - 115%), giá trị R2 của hai lần<br />
khảo sát lần lượt là 0,995 và 0,993. Như vậy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát, có sự<br />
tương quan tuyến tính giữa nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng và diện tích píc<br />
thu được. Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng.<br />
Bảng 2: Nồng độ diclofenac trong các mẫu chuẩn tính theo phương trình hồi quy.<br />
STT<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
Nồng độ thực (ng/ml)<br />
<br />
Nồng độ tìm thấy (ng/ml)<br />
<br />
Độ đúng (%)<br />
<br />
516,3<br />
<br />
528,9<br />
<br />
102,45<br />
<br />
508,1<br />
<br />
549,1<br />
<br />
108,06<br />
<br />
1032,5<br />
<br />
997,0<br />
<br />
96,56<br />
<br />
1016,3<br />
<br />
1130,4<br />
<br />
111,23<br />
<br />
1425,0<br />
<br />
1553,0<br />
<br />
108,98<br />
<br />
1512,5<br />
<br />
1481,8<br />
<br />
97,97<br />
<br />
105<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
7<br />
<br />
8<br />
<br />
2065,0<br />
<br />
1903,9<br />
<br />
92,20<br />
<br />
2032,5<br />
<br />
1925,7<br />
<br />
94,75<br />
<br />
2850,0<br />
<br />
3078,0<br />
<br />
108,00<br />
<br />
3025,0<br />
<br />
3322,0<br />
<br />
109,82<br />
<br />
4100,0<br />
<br />
3909,0<br />
<br />
95,34<br />
<br />
4065,0<br />
<br />
3929,4<br />
<br />
96,67<br />
<br />
5700,0<br />
<br />
5936,6<br />
<br />
104,15<br />
<br />
6050,0<br />
<br />
5754,7<br />
<br />
95,12<br />
<br />
8200,0<br />
<br />
8092,7<br />
<br />
98,69<br />
<br />
8130,0<br />
<br />
8455,6<br />
<br />
104,00<br />
<br />
Chuẩn bị 6 mẫu chuẩn có nồng độ diclofenac 516,3 ng/ml. Tiến hành định lượng bằng<br />
phương pháp HPLC. Tính kết quả dựa theo đường chuẩn pha trong dịch tiền phòng với<br />
cùng điều kiện. Kết quả cho thấy nồng độ tìm thấy so với giá trị thực (102,45%; 104,45%;<br />
101, 61%; 108,12%; 100,28%; 104,28%) đều nằm trong khoảng 80 - 120% và có RSD<br />
(2,66%) < 20%. Do đó, nồng độ 516,3 ng/ml đạt yêu cầu giới hạn định lượng dưới.<br />
4. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác.<br />
Bảng 3: Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày (n = 3).<br />
LQC (1.121 ng/ml)<br />
Mẫu<br />
<br />
Diện tích Nồng độ<br />
píc AD<br />
AD<br />
(mAu.s) (ng/ml)<br />
<br />
MQC (3.483 ng/ml)<br />
<br />
Độ đúng<br />
(%)<br />
<br />
Diện tích<br />
píc AD<br />
(mAu.s)<br />
<br />
HQC (6.530 ng/ml)<br />
<br />
Nồng độ Độ đúng<br />
AD (ng/ml)<br />
(%)<br />
<br />
Diện tích<br />
píc AD<br />
<br />
Nồng độ<br />
AD<br />
<br />
(mAu.s)<br />
<br />
(ng/ml)<br />
<br />
Độ đúng<br />
(%)<br />
<br />
1<br />
<br />
144,3<br />
<br />
1108,2<br />
<br />
98,86<br />
<br />
428,7<br />
<br />
3559,9<br />
<br />
102,21<br />
<br />
777,1<br />
<br />
6563,4<br />
<br />
100,51<br />
<br />
2<br />
<br />
152,4<br />
<br />
1178,0<br />
<br />
105,09<br />
<br />
407,6<br />
<br />
3378,0<br />
<br />
96,99<br />
<br />
759,8<br />
<br />
6414,2<br />
<br />
98,23<br />
<br />
3<br />
<br />
139,4<br />
<br />
1066,0<br />
<br />
95,09<br />
<br />
419,2<br />
<br />
3478,0<br />
<br />
99,86<br />
<br />
752,7<br />
<br />
6353,0<br />
<br />
97,29<br />
<br />
4<br />
<br />
143,3<br />
<br />
1099,6<br />
<br />
98,09<br />
<br />
437,3<br />
<br />
3634,1<br />
<br />
104,33<br />
<br />
764,9<br />
<br />
6458,2<br />
<br />
98,9<br />
<br />
5<br />
<br />
140,6<br />
<br />
1076,3<br />
<br />
96,01<br />
<br />
408,4<br />
<br />
3384,9<br />
<br />
97,18<br />
<br />
769,2<br />
<br />
6495,3<br />
<br />
99,47<br />
<br />
6<br />
<br />
156,6<br />
<br />
1214,2<br />
<br />
108,32<br />
<br />
402,1<br />
<br />
3330,6<br />
<br />
95,62<br />
<br />
796,5<br />
<br />
6730,6<br />
<br />
103,07<br />
<br />
TB<br />
<br />
100,24<br />
<br />
99,37<br />
<br />
99,58<br />
<br />
RSD %<br />
<br />
5,27<br />
<br />
3,41<br />
<br />
2,04<br />
<br />
Kết quả phân tích đều có độ đúng nằm trong khoảng 85 - 115%, độ lệch chuẩn<br />
tương đối RSD tương ứng 5,27%; 3,41%; 2,04%; < 15%. Như vậy, phương pháp phân<br />
tích đã đạt yêu cầu của FDA về tiêu chuẩn độ đúng, độ lặp lại trong ngày.<br />
106<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
