Thu nhận và tinh sạch phytase ngoại bào từ nấm men Sporobolomyces japonicus

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PHYTASE NGOẠI BÀO<br /> TỪ NẤM MEN Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> Hoàng Quốc Khánh1*, Ngô Đức Duy1, Đào Thị Thu Hiền1, Trịnh Phong Vân2<br /> (1)<br /> <br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)hoangqk@gmail.com<br /> (2)<br /> Đại học Kinh tế Kỹ thuật Bình Dương<br /> <br /> TÓM TẮT: Phytase từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) phân lập từ rừng Nam Cát Tiên được<br /> nuôi cấy trong môi trưởng YPD cải tiến cho hoạt độ phytase là 2,720 UI/ml và nhiệt độ và pH tối ưu cho<br /> phytase thu nhận là 40oC, pH 4,0. Tác nhân tủa thích hợp cho phytase là ethanol 96%, với hoạt tính riêng<br /> đạt được là 312,924 UI/mg protein. Các ion Ca2+ nồng độ 1 mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase<br /> và Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase ở nồng độ 5 mmol/ml. Hoạt độ riêng của phytase là 187,942<br /> đối với peak 1 và 286,388 đối với peak 2. Hoạt độ riêng của tổng 2 peak tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc<br /> ký. Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% và hiệu suất hoạt độ đạt 90,75%. Hằng số Michaelis (Km) của<br /> phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km = 0,0313. Điều này cho thấy ái lực cao giữa phytase<br /> với cơ chất sodium phytate. Trọng lượng phân tử phytase của sporobolomyces japonicus là 36,90 KDa.<br /> Từ khóa: Sporobomyces japonicus, phytase, hoạt độ riêng, Ca2+, Mn2+, Km.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Phytase<br /> là<br /> một<br /> enzyme<br /> acid<br /> phosphohyrolase, xúc tác thủy phân acid phytic<br /> thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myoinositol phosphate. Phytase được tìm thấy ở vi<br /> sinh vật như nấm mốc, vi khuẩn, mấn men...<br /> Phytase được chú ý ứng dụng trong công nghệ<br /> sinh học, đặc biệt trong việc giảm nhiễm<br /> photpho ở những vùng chăn nuôi tập trung [2].<br /> Sự thủy phân acid phytic bằng phytase sẽ không<br /> sinh ra những độc tố, vì vậy, khai thác phytase<br /> trong công nghiệp sẽ thân thiện với môi trường<br /> và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển các công nghệ<br /> mới.<br /> Hiện nay, phytase được quan tâm và nghiên<br /> cứu nhiều, đặc biệt là phytase từ nấm mốc bởi<br /> vì nấm mốc có khả năng sản xuất phytase có<br /> hoạt tính cao [5]. Phytase của vi khuẩn và nấm<br /> men cũng được quan tâm nghiên cứu và ứng<br /> dụng [4]. Nghiên cứu sản xuất phytase từ nấm<br /> men cũng là một hướng quan trọng so với nấm<br /> mốc bởi vì nấm men đảm bảo an toàn nhiều hơn<br /> trong ứng dựng chế biến thực phẩm cho người<br /> và gia súc, và nấm men không sinh ra độc tốc.<br /> Ngoài ra, công nghệ sản xuất phytase từ nấm<br /> men cũng đơn giản hơn so với nấm mốc. Trong<br /> khuôn khổ hợp tác với BIOTEC (Thái Lan),<br /> chúng tôi đã sưu tập một số chủng nấm men tại<br /> vườn quốc gia Cát Tiên (số liệu chưa xuất bản).<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu, hóa chất và môi trường<br /> Chủng nấm men Sporobolomyces japonicus<br /> (L9) được phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên,<br /> trong bộ sưu tập của Phòng Vi sinh ứng dụng,<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và<br /> Công nghệ Việt Nam.<br /> Dung dịch đệm và thuốc khử: Đệm acetate<br /> 0,2 M, pH 5,5; đệm glycine-HCl 0,2 M, pH 2,0,<br /> 2,5, 3,0 và 3,5; đệm Tris-HCl 0,2 M, pH 7,0, 7,5<br /> và 8,0 [3]. Coomassive Brilliant blue, Thuốc thử<br /> Bradford (Bio-Rad).<br /> Môi trường: Yeast Malt (YM) và Yeast Malt<br /> Agar (YMA); môi trường YM bổ sung 20%<br /> Glycerol; môi trường chọn lọc nấm men sinh<br /> tổng hợp phytase: môi trường Schopfer; môi<br /> trường lên men sinh tổng hợp phytase: môi<br /> trường bột bắp; môi trường Yeast Extract<br /> Peptone Dextrose (YPD) với 0,5% Na-phytate.<br /> Phương pháp<br /> Thí nghiệm về ảnh hưởng của pH lên hoạt<br /> tính của enzyme được thực hiện như sau: phản<br /> ứng enzyme và cơ chất tiến hành trong khoảng<br /> pH 2,0 đến 7,5 ở nhiệt độ 37oC trong thời gian<br /> là 15 phút. Các loại đệm thực hiện trong thí<br /> nghiệm có nồng độ 200 mM bao gồm HCl (pH<br /> 2,0-3,5), acetate (pH 4,0-6,5) và Tris-HCl (pH<br /> 7,0-7,5). Thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiện đô<br /> thực hiện trong dãy nhiệt từ 30oC đến 80oC<br /> trong thời gian là 15 phút. Thí nghiệm khảo sát<br /> ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính<br /> 91<br /> <br /> Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van<br /> <br /> phytase ủ trong sự có mặt của các ion kim loại<br /> Ca2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ và chất<br /> ức chế EDTA với nồng độ 1 mM/ml và 5<br /> mM/ml ở 37o C trong 15 phút để xác định hoạt<br /> tính còn lại của phytase.<br /> Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp<br /> đo độ đục và buồng đếm hồng cầu; xác định<br /> hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp<br /> Murphy và Riley [3]; xác định hàm lượng<br /> protein theo phương pháp Bradfrod [1]; tinh<br /> sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel<br /> (Biogel P-100) mô tả bởi Bio-Rab; xác định<br /> trọng lượng phân tử của phytase bằng phương<br /> pháp chạy điện di SDS-PAGE [1].<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Sàng lọc sơ bộ chủng nấm men sinh tổng hợp<br /> phytase<br /> Từ bộ sưu tập về nấm men thu thập từ rừng<br /> Nam Cát Tiên, chúng tôi đã sàng lọc từ 37<br /> chủng nấm men và xác định những chủng nấm<br /> men có khả năng sinh tổng hợp phytase. Dựa<br /> vào các kết quả nghiên cứu sơ bộ, chúng tôi<br /> chọn ra 3 chủng nấm men (định danh dựa vào<br /> vùng gen 26S rDNA thuộc vùng D1/D2)<br /> là<br /> Sporobolomyces<br /> japonicus<br /> (L9),<br /> <br /> Sporobolomyces<br /> carnicolor<br /> (L62)<br /> và<br /> Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K-490<br /> (L40), có khả năng sinh tổng hợp phytase cao<br /> trong môi trường bột bắp là 1,63 UI/mol và<br /> YPD cải tiến có bổ sung 0,5% natri phytate làm<br /> nguồn cơ chất cảm ứng. Chúng tôi nhận thấy,<br /> chủng L9 cho hoạt độ cao nhất 1,46 UI/ml, nên<br /> chúng tôi chọn chủng L9 vì quá trình thu nhận<br /> enzyme thuận lợi hơn môi trường bột bắp và<br /> được định danh là chủng Sporobolomyces<br /> japonicus với accession number AY07009.1.<br /> Khảo sát thời gian nuôi lên men thích hợp<br /> cho sinh tổng hợp phytase của chủng<br /> Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> Tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy từ<br /> chủng nấm men L9 trong môi trường YPD 0,5%<br /> sodium phytate được thu nhân mẫu sau mỗi 24<br /> giờ và thời gian lên men trong 10 ngày. Kết quả<br /> thu được theo hình 1 cho thấy, phytase được<br /> tổng hợp trong giai đoạn sớm của quá trình lên<br /> men và đạt hàm lượng cao nhất ở ngày thứ 5<br /> (1,49 UI/ml). Hoạt tính enzyme bắt đầu giảm<br /> nhẹ ở ngày thứ 6, 7, 8 và giảm mạnh ở ngày lên<br /> men thứ 9 và 10. Sự tăng giảm hoạt tính của<br /> phytase tương ứng với sự thay đổi mật độ tế bào<br /> theo thời gian lên men.<br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính phytase<br /> của chủng Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> 92<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống bổ sung ban đầu đến quá trình sản xuất phytase<br /> Khảo sát tỉ lệ bổ sung giống thích hợp cho<br /> sản xuất phytase<br /> Chủng Sporobolomyces japonicus (L9 ) được<br /> hoạt hóa trong môi trường Schopfer sau 48 giờ,<br /> lần lượt bổ sung tỉ lệ giống (v/v) 1%, 2%, 3%,<br /> 4%, 5% và 6% (mật độ tế bào là 6.108 CFU/ml)<br /> vào môi trường YPD bổ sung 0,5% sodium<br /> phytate. Sau 5 ngày lên men, hoạt tính phytase<br /> và mật độ tế bào của dịch lên men được xác<br /> định kết quả trên hình 2, với tỉ lệ giống từ 3%<br /> đến 6% có hoạt tính phytase tương đối cao và<br /> hàm lương phytase ở 4% là cao nhất (2,72<br /> UI/ml). Kết quả trên cho thấy, tỷ lệ giống bổ<br /> <br /> sung ban đầu 4% thích hợp cho quá trình sinh<br /> tổng hợp phytase.<br /> Khảo sát các tác nhân tủa thích hợp để thu<br /> nhận phytase<br /> Sau khi lên men sản xuất phytase ở những<br /> điều kiện thích hợp, việc thu nhận và tinh sạch<br /> enzyme phytase cũng là một trong những khâu<br /> quan trọng trong việc khảo sát các tác nhân tủa<br /> ở những nồng độ khác nhau lên hoạt tính<br /> enzyme phytase, chúng tôi sử dụng các tác nhân<br /> tủa như ethanol 96%, acetone và ammonium<br /> sulfate kết quả trình bày ở bảng 2.<br /> <br /> Bảng 1. Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật<br /> Chủng khảo sát<br /> L9<br /> L40<br /> L62<br /> <br /> Hàm lượng protein<br /> mg /ml<br /> 0,049<br /> 0,026<br /> 0,031<br /> <br /> HĐ chung<br /> UI/ml<br /> 1,455<br /> 0,451<br /> 0,347<br /> <br /> Bảng 2. So sánh hoạt độ phytase theo các tác nhân tủa<br /> Tác nhân tủa<br /> <br /> Lượng tủa (g)<br /> <br /> Cồn<br /> 1,1043<br /> Acetone<br /> 1,1156<br /> Muối amôn<br /> 1,1337<br /> CPE - Chế phẩm enzyme<br /> <br /> Hàm lượng protein<br /> mg /g<br /> 0,205<br /> 0,457<br /> 0,363<br /> <br /> Như vậy, dựa vào kết quả hoạt tính riêng<br /> thì ethanol 96% với tỉ lệ được chọn là tác nhân<br /> tủa thích hợp nhằm thu nhận phytase của chủng<br /> Sporobolomyces japonicus (L9).<br /> <br /> HĐ chung<br /> UI/gCPE<br /> 63,885<br /> 48,418<br /> 78,447<br /> <br /> HĐ riêng<br /> UI/mg protein<br /> 311,365<br /> 106,006<br /> 215,932<br /> <br /> Khảo sát sinh lý và sinh hóa của phytase<br /> được<br /> sinh<br /> tổng<br /> hợp<br /> bởi<br /> chủng<br /> Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase<br /> 93<br /> <br /> Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase<br /> Kết quả về ảnh hưởng của pH lên hoạt tính<br /> phytase thể hiện ở hình 3.<br /> <br /> Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase<br /> <br /> Biên độ pH giao động trong khoảng pH 4,06,5 cho hoạt tính phytase tốt, nhưng và cao nhất<br /> là pH = 4,0 (74,104 UI/g), tuy nhiên trong dãy<br /> pH 2,0-3,5 thì hoạt tính phytase tương đối yếu.<br /> <br /> Kết quả theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ<br /> cho thấy, phytase đạt hoạt tính cao ở nhiệt 40oC,<br /> khi nhiệt độ trên 70oC thì hoạt độ phytase giảm<br /> mạnh (hình 4).<br /> <br /> Hinh 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase<br /> 94<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> 60<br /> 50<br /> 40<br /> 30<br /> 20<br /> 10<br /> <br /> UI/gCPE<br /> <br /> Hoạt độ chung phytase UI/gCPE<br /> <br /> 70<br /> <br /> 0<br /> 2+<br /> <br /> Ca<br /> <br /> 2+<br /> <br /> Cu<br /> <br /> Fe<br /> <br /> 2+<br /> <br /> Fe<br /> <br /> 3+<br /> <br /> Mg<br /> <br /> 2+<br /> <br /> 2+<br /> <br /> Mn<br /> <br /> 2+<br /> <br /> Zn<br /> <br /> EDTA<br /> <br /> Các ion kim loại và chất ức chế EDTA với nồng độ 1 mmol/ml<br /> <br /> Hình 5. Biến thiên hoạt độ phytase do sự tác động của các ion kim loại ở nồng độ 1 mmol/ml<br /> Ảnh hưởng của ion kim loại lên sự ổn định<br /> của phytase<br /> Kết quả về ảnh hưởng của ion kim loại lên<br /> sự ổn định của phytase được trình bày ở hình 5.<br /> Khi cho phytase tương tác với các ion kim<br /> loại trong 2 nồng độ là 1 mM và 5 mM chứng tỏ<br /> nhận thấy, có sự tương tác khác nhau, nồng độ 5<br /> mM kìm hãm khả năng hoạt động của enzyme<br /> mạnh hơn so với nồng độ 1 mM.<br /> Khi nồng độ 1 mM, thì sự kìm hãm hoạt tính<br /> phytase của ion Fe3+ (hoạt tính còn lại 87,6%) ít<br /> hơn so với những ion khác. Trong khi đó, cả hai<br /> <br /> nồng độ của ion Ca2+ đều kìm hãm hoạt động<br /> phytase và các ion còn lại cũng tương tự.<br /> Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký<br /> lọc gel<br /> Tinh sạch enzyme phytase bằng phương<br /> pháp sắc ký lọc gel sau khi đã tủa và hòa tan<br /> trong đệm acetate pH 4,0. Kết quả sau khi chạy<br /> sắc ký cho thấy 2 đỉnh theo hình 6, trong đó,<br /> đỉnh 1 trong phân đoạn 7-14 ml và đỉnh 2 từ 1827 ml sau khi thu nhận và đem xác định hàm<br /> lượng protein cùng với hoạt tính phytase cho kết<br /> quả hiệu suất thu hồi hoạt độ và hiệu suất thu<br /> hồi protein theo như bảng 3.<br /> <br /> Hình 6. Sắc ký đồ phytase của Sporobolomyces japonicus<br /> 95<br /> <br />