Thu nhận và tinh sạch Phytase ngoại bào từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9)

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PHYTASE NGOẠI BÀO<br /> TỪ NẤM MEN Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> <br /> Hoàng Quốc Khánh1*, Ngô Đức Duy1, Đào Thị Thu Hiền1, Trịnh Phong Vân2<br /> (1)<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)hoangqk@gmail.com<br /> (2)<br /> Đại học Kinh tế Kỹ thuật Bình Dương<br /> <br /> TÓM TẮT: Phytase từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) phân lập từ rừng Nam Cát Tiên được<br /> nuôi cấy trong môi trưởng YPD cải tiến cho hoạt độ phytase là 2,720 UI/ml và nhiệt độ và pH tối ưu cho<br /> phytase thu nhận là 40oC, pH 4,0. Tác nhân tủa thích hợp cho phytase là ethanol 96%, với hoạt tính riêng<br /> đạt được là 312,924 UI/mg protein. Các ion Ca2+ nồng độ 1 mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase<br /> và Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase ở nồng độ 5 mmol/ml. Hoạt độ riêng của phytase là 187,942<br /> đối với peak 1 và 286,388 đối với peak 2. Hoạt độ riêng của tổng 2 peak tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc<br /> ký. Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% và hiệu suất hoạt độ đạt 90,75%. Hằng số Michaelis (Km) của<br /> phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km = 0,0313. Điều này cho thấy ái lực cao giữa phytase<br /> với cơ chất sodium phytate. Trọng lượng phân tử phytase của sporobolomyces japonicus là 36,90 KDa.<br /> Từ khóa: Sporobomyces japonicus, phytase, hoạt độ riêng, Ca2+, Mn2+, Km.<br /> <br /> MỞ ĐẦU Vật liệu, hóa chất và môi trường<br /> Phytase là một enzyme acid Chủng nấm men Sporobolomyces japonicus<br /> phosphohyrolase, xúc tác thủy phân acid phytic (L9) được phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên,<br /> thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myo- trong bộ sưu tập của Phòng Vi sinh ứng dụng,<br /> inositol phosphate. Phytase được tìm thấy ở vi Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và<br /> sinh vật như nấm mốc, vi khuẩn, mấn men... Công nghệ Việt Nam.<br /> Phytase được chú ý ứng dụng trong công nghệ Dung dịch đệm và thuốc khử: Đệm acetate<br /> sinh học, đặc biệt trong việc giảm nhiễm 0,2 M, pH 5,5; đệm glycine-HCl 0,2 M, pH 2,0,<br /> photpho ở những vùng chăn nuôi tập trung [2]. 2,5, 3,0 và 3,5; đệm Tris-HCl 0,2 M, pH 7,0, 7,5<br /> Sự thủy phân acid phytic bằng phytase sẽ không và 8,0 [3]. Coomassive Brilliant blue, Thuốc thử<br /> sinh ra những độc tố, vì vậy, khai thác phytase Bradford (Bio-Rad).<br /> trong công nghiệp sẽ thân thiện với môi trường<br /> Môi trường: Yeast Malt (YM) và Yeast Malt<br /> và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển các công nghệ<br /> Agar (YMA); môi trường YM bổ sung 20%<br /> mới.<br /> Glycerol; môi trường chọn lọc nấm men sinh<br /> Hiện nay, phytase được quan tâm và nghiên tổng hợp phytase: môi trường Schopfer; môi<br /> cứu nhiều, đặc biệt là phytase từ nấm mốc bởi trường lên men sinh tổng hợp phytase: môi<br /> vì nấm mốc có khả năng sản xuất phytase có trường bột bắp; môi trường Yeast Extract<br /> hoạt tính cao [5]. Phytase của vi khuẩn và nấm Peptone Dextrose (YPD) với 0,5% Na-phytate.<br /> men cũng được quan tâm nghiên cứu và ứng<br /> Phương pháp<br /> dụng [4]. Nghiên cứu sản xuất phytase từ nấm<br /> men cũng là một hướng quan trọng so với nấm Thí nghiệm về ảnh hưởng của pH lên hoạt<br /> mốc bởi vì nấm men đảm bảo an toàn nhiều hơn tính của enzyme được thực hiện như sau: phản<br /> trong ứng dựng chế biến thực phẩm cho người ứng enzyme và cơ chất tiến hành trong khoảng<br /> và gia súc, và nấm men không sinh ra độc tốc. pH 2,0 đến 7,5 ở nhiệt độ 37oC trong thời gian<br /> Ngoài ra, công nghệ sản xuất phytase từ nấm là 15 phút. Các loại đệm thực hiện trong thí<br /> men cũng đơn giản hơn so với nấm mốc. Trong nghiệm có nồng độ 200 mM bao gồm HCl (pH<br /> khuôn khổ hợp tác với BIOTEC (Thái Lan), 2,0-3,5), acetate (pH 4,0-6,5) và Tris-HCl (pH<br /> chúng tôi đã sưu tập một số chủng nấm men tại 7,0-7,5). Thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiện đô<br /> vườn quốc gia Cát Tiên (số liệu chưa xuất bản). thực hiện trong dãy nhiệt từ 30oC đến 80oC<br /> trong thời gian là 15 phút. Thí nghiệm khảo sát<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính<br /> <br /> <br /> 91<br />  Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van<br /> <br /> phytase ủ trong sự có mặt của các ion kim loại Sporobolomyces carnicolor (L62) và<br /> Ca2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ và chất Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K-490<br /> ức chế EDTA với nồng độ 1 mM/ml và 5 (L40), có khả năng sinh tổng hợp phytase cao<br /> mM/ml ở 37o C trong 15 phút để xác định hoạt trong môi trường bột bắp là 1,63 UI/mol và<br /> tính còn lại của phytase. YPD cải tiến có bổ sung 0,5% natri phytate làm<br /> Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp nguồn cơ chất cảm ứng. Chúng tôi nhận thấy,<br /> đo độ đục và buồng đếm hồng cầu; xác định chủng L9 cho hoạt độ cao nhất 1,46 UI/ml, nên<br /> hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp chúng tôi chọn chủng L9 vì quá trình thu nhận<br /> enzyme thuận lợi hơn môi trường bột bắp và<br /> Murphy và Riley [3]; xác định hàm lượng<br /> được định danh là chủng Sporobolomyces<br /> protein theo phương pháp Bradfrod [1]; tinh japonicus với accession number AY07009.1.<br /> sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel<br /> (Biogel P-100) mô tả bởi Bio-Rab; xác định Khảo sát thời gian nuôi lên men thích hợp<br /> trọng lượng phân tử của phytase bằng phương cho sinh tổng hợp phytase của chủng<br /> pháp chạy điện di SDS-PAGE [1]. Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> Tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy từ<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chủng nấm men L9 trong môi trường YPD 0,5%<br /> Sàng lọc sơ bộ chủng nấm men sinh tổng hợp sodium phytate được thu nhân mẫu sau mỗi 24<br /> phytase giờ và thời gian lên men trong 10 ngày. Kết quả<br /> thu được theo hình 1 cho thấy, phytase được<br /> Từ bộ sưu tập về nấm men thu thập từ rừng<br /> tổng hợp trong giai đoạn sớm của quá trình lên<br /> Nam Cát Tiên, chúng tôi đã sàng lọc từ 37<br /> men và đạt hàm lượng cao nhất ở ngày thứ 5<br /> chủng nấm men và xác định những chủng nấm<br /> (1,49 UI/ml). Hoạt tính enzyme bắt đầu giảm<br /> men có khả năng sinh tổng hợp phytase. Dựa<br /> nhẹ ở ngày thứ 6, 7, 8 và giảm mạnh ở ngày lên<br /> vào các kết quả nghiên cứu sơ bộ, chúng tôi<br /> men thứ 9 và 10. Sự tăng giảm hoạt tính của<br /> chọn ra 3 chủng nấm men (định danh dựa vào<br /> phytase tương ứng với sự thay đổi mật độ tế bào<br /> vùng gen 26S rDNA thuộc vùng D1/D2)<br /> theo thời gian lên men.<br /> là Sporobolomyces japonicus (L9),<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính phytase<br /> của chủng Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> <br /> <br /> 92<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống bổ sung ban đầu đến quá trình sản xuất phytase<br /> <br /> Khảo sát tỉ lệ bổ sung giống thích hợp cho sung ban đầu 4% thích hợp cho quá trình sinh<br /> sản xuất phytase tổng hợp phytase.<br /> Chủng Sporobolomyces japonicus (L9 ) được Khảo sát các tác nhân tủa thích hợp để thu<br /> hoạt hóa trong môi trường Schopfer sau 48 giờ, nhận phytase<br /> lần lượt bổ sung tỉ lệ giống (v/v) 1%, 2%, 3%, Sau khi lên men sản xuất phytase ở những<br /> 4%, 5% và 6% (mật độ tế bào là 6.108 CFU/ml) điều kiện thích hợp, việc thu nhận và tinh sạch<br /> vào môi trường YPD bổ sung 0,5% sodium enzyme phytase cũng là một trong những khâu<br /> phytate. Sau 5 ngày lên men, hoạt tính phytase quan trọng trong việc khảo sát các tác nhân tủa<br /> và mật độ tế bào của dịch lên men được xác ở những nồng độ khác nhau lên hoạt tính<br /> định kết quả trên hình 2, với tỉ lệ giống từ 3% enzyme phytase, chúng tôi sử dụng các tác nhân<br /> đến 6% có hoạt tính phytase tương đối cao và tủa như ethanol 96%, acetone và ammonium<br /> hàm lương phytase ở 4% là cao nhất (2,72 sulfate kết quả trình bày ở bảng 2.<br /> UI/ml). Kết quả trên cho thấy, tỷ lệ giống bổ<br /> <br /> Bảng 1. Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật<br /> Hàm lượng protein HĐ chung<br /> Chủng khảo sát<br /> mg /ml UI/ml<br /> L9 0,049 1,455<br /> L40 0,026 0,451<br /> L62 0,031 0,347<br /> <br /> Bảng 2. So sánh hoạt độ phytase theo các tác nhân tủa<br /> Hàm lượng protein HĐ chung HĐ riêng<br /> Tác nhân tủa Lượng tủa (g)<br /> mg /g UI/gCPE UI/mg protein<br /> Cồn 1,1043 0,205 63,885 311,365<br /> Acetone 1,1156 0,457 48,418 106,006<br /> Muối amôn 1,1337 0,363 78,447 215,932<br /> CPE - Chế phẩm enzyme<br /> <br /> Như vậy, dựa vào kết quả hoạt tính riêng Khảo sát sinh lý và sinh hóa của phytase<br /> thì ethanol 96% với tỉ lệ được chọn là tác nhân được sinh tổng hợp bởi chủng<br /> tủa thích hợp nhằm thu nhận phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> Sporobolomyces japonicus (L9). Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase<br /> <br /> 93<br />  Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase<br /> <br /> Kết quả về ảnh hưởng của pH lên hoạt tính Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase<br /> phytase thể hiện ở hình 3.<br /> Biên độ pH giao động trong khoảng pH 4,0- Kết quả theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ<br /> 6,5 cho hoạt tính phytase tốt, nhưng và cao nhất cho thấy, phytase đạt hoạt tính cao ở nhiệt 40oC,<br /> là pH = 4,0 (74,104 UI/g), tuy nhiên trong dãy khi nhiệt độ trên 70oC thì hoạt độ phytase giảm<br /> pH 2,0-3,5 thì hoạt tính phytase tương đối yếu. mạnh (hình 4).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hinh 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase<br /> <br /> <br /> 94<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> <br /> 70<br /> <br /> Hoạt độ chung phytase UI/gCPE 60<br /> <br /> 50<br /> <br /> 40<br /> <br /> 30<br /> <br /> 20<br /> UI/gCPE<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 10<br /> <br /> 0<br /> 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 2+<br /> Ca Cu Fe Fe Mg Mn Zn EDTA<br /> Các ion kim loại và chất ức chế EDTA với nồng độ 1 mmol/ml<br /> <br /> Hình 5. Biến thiên hoạt độ phytase do sự tác động của các ion kim loại ở nồng độ 1 mmol/ml<br /> <br /> Ảnh hưởng của ion kim loại lên sự ổn định nồng độ của ion Ca2+ đều kìm hãm hoạt động<br /> của phytase phytase và các ion còn lại cũng tương tự.<br /> Kết quả về ảnh hưởng của ion kim loại lên Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký<br /> sự ổn định của phytase được trình bày ở hình 5. lọc gel<br /> Khi cho phytase tương tác với các ion kim Tinh sạch enzyme phytase bằng phương<br /> loại trong 2 nồng độ là 1 mM và 5 mM chứng tỏ pháp sắc ký lọc gel sau khi đã tủa và hòa tan<br /> nhận thấy, có sự tương tác khác nhau, nồng độ 5 trong đệm acetate pH 4,0. Kết quả sau khi chạy<br /> mM kìm hãm khả năng hoạt động của enzyme sắc ký cho thấy 2 đỉnh theo hình 6, trong đó,<br /> mạnh hơn so với nồng độ 1 mM. đỉnh 1 trong phân đoạn 7-14 ml và đỉnh 2 từ 18-<br /> Khi nồng độ 1 mM, thì sự kìm hãm hoạt tính 27 ml sau khi thu nhận và đem xác định hàm<br /> phytase của ion Fe3+ (hoạt tính còn lại 87,6%) ít lượng protein cùng với hoạt tính phytase cho kết<br /> hơn so với những ion khác. Trong khi đó, cả hai quả hiệu suất thu hồi hoạt độ và hiệu suất thu<br /> hồi protein theo như bảng 3.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Sắc ký đồ phytase của Sporobolomyces japonicus<br /> <br /> <br /> 95<br />  Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 7. Kết quả điện di đồ enzyme phytase sau khi tủa ethanol<br /> Giếng 1. Phytase thương mại; giếng 2, 3. Phytase sau khi tủa bởi cồn;<br /> Giếng 4. Thang protein chuẩn.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh sạch của phytase sau sắc ký Enzyme phytase thu hồi sau sắc ký được<br /> và xác định trọng lượng phân tử phytase cho phản ứng với cơ chất natri phytate ở các<br /> Phương pháp SDS-PAGE được tiến hành để nồng độ 0,05, 010, 0,15, 0,20 và 0 25 mM trong<br /> kiểm tra độ tinh sạch của enzyme phytase sau các khoảng thời gian 10, 15, 30, 45 và 60 phút.<br /> sắc ký và đồng thời xác định trọng lượng phân Với nồng độ 0,05 mM, thời gian phản ứng là 10<br /> tử phytase sinh tổng hợp từ chủng phút, còn lại các nồng độ cơ chất 0,10, 0,15,<br /> Sporobolomyces japonicus (L9) kết quả chỉ ra ở 0,20 và 0,25 mM thì vận tốc phản ứng tối đa<br /> hình 7. Vmax của phytase là 15 phút.<br /> Xác định hằng số Km phản ứng enzyme-cơ Tính vận tốc phản ứng (V) và theo mỗi nồng<br /> chất natri phytate độ cơ chất [S]<br /> <br /> Bảng 3. So sánh hoạt tính phytase, hàm lượng protein trước và sau khi sắc ký và hiệu suất thu hồi<br /> Hàm lượng Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng<br /> Mẫu<br /> protein (mg/ml) (UI/ml) (UI/mg protein)<br /> Mẩu trước khi sắc ký 0,465 118,91 258,048<br /> Đỉnh 1 0,181 33,958 187,942<br /> Đỉnh 2 0,261 74,845 286,388<br /> Tổng 2 đỉnh 0,442 108,803 474,330<br /> Hiệu suất thu hồi protein (%) 95,05<br /> Hiệu suất thu hổi hoạt tính (%) 90,75<br /> <br /> <br /> 96<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98<br /> <br /> Xác định hằng số Km và vận tốc phản ứng xúc Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng tăng, tuy<br /> tác tối đa Vmax thông qua phương trình Xác định nhiên, sau một thời nồng độ cơ chất bão hòa và<br /> hằng số Km và vận tốc phản ứng xúc tác tối đa giảm dần. Nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi<br /> (Vmax) thông qua phương trình Line Weak Buk. Sử tăng nồng độ cơ chất [S] từ 0,05 mM đến 0,20<br /> dụng phần mềm Sigma plot để vẽ đồ thị và tính mM, và vận tốc bắt đầu giảm dần khi tăng nồng<br /> toán Km, Vmax, kết quả chỉ ra ở theo bảng 3. độ cơ chất từ 0,20 mM đến 0,25 mM.<br /> <br /> <br /> <br /> Lineweaver-Burk<br /> 0,04<br /> <br /> <br /> <br /> 0,03<br /> <br /> -1/Vmax<br /> <br /> 0,02<br /> <br /> <br /> 1/Rate (µmol/min/ml)<br /> 0,01<br /> <br /> -1/Km<br /> <br /> <br /> -40 -30 -20 -10 0 10 20 30<br /> Vmax = 35.<br /> 1/[Substrate] (mM)<br /> Km = 0,03128<br /> Hình 8. Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk xác định hằng số Km của phytase<br /> <br /> Đồ thị hình 8 cho thấy, hằng số Km của japonicus (L9 ) trong môi trường lỏng YPD cải<br /> phytase nấm men Sporobolomyces japonicus tiến (có bổ sung 0,5% sodium phytate) thời gian<br /> (L9) là 0,03128 mM. Hằng số Km cho biết ái lực là 5 ngày với tỉ lệ bổ sung 4% giống cho hoạt độ<br /> giữa enzyme và cơ chất, mạnh hay yếu và đây là phytase là 2,720 UI/ml và nhiệt độ và pH tối ưu<br /> chủng nấm men mới được nghiên cứu về hoạt cho phytase thu nhận là 40oC, pH 4,0.<br /> tính phytase của nó, vì vậy, chúng tôi sẽ so sánh<br /> Tác nhân tủa thích hợp cho phytase là<br /> Km của chủng Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> ethanol 96%, với tỉ lệ dung môi/dung dịch<br /> với các hằng số Km của một số nấm men đã<br /> phytase là 1: 2, thời gian tủa thích hợp nhất là 2<br /> được nghiên cứu trước đây [6]. Kết qua cho<br /> giờ. Hoạt tính riêng đạt được là 312,924 UI/mg<br /> thấy, hằng số Km của chủng Sporobolomyces<br /> protein.<br /> japonicas là 0,031 mM, điều này cũng cho thấy,<br /> ái lực của phytase và cơ chất sodium phytate là Các ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt độ<br /> khá cao. phytase như Ca2+ nồng độ 1 mmol/ml làm giảm<br /> đến 97% hoạt độ phytase. Mn2+ làm giảm đến<br /> KẾT LUẬN 98% hoạt độ phytase ở nồng độ 5 mmol/ml.<br /> Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình Hoạt độ riêng của phytase là 187,94 đối với<br /> sản xuất phytase của chủng Sporobolomyces đỉnh 1 và 286,39 đối với đỉnh 2. Hoạt độ riêng<br /> <br /> <br /> 97<br />  Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van<br /> <br /> của tổng 2 đỉnh tăng 1,8 lần so với mẫu trước of phytase, Applied Microbiology and<br /> sắc ký. Biotechnology, 68: 588-597.<br /> Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% và 3. Kim T. W., Lei X. G., 2005. An improving<br /> hiệu suất hoạt độ đạt 90,75%. method for a rapid determination of phytase<br /> Hằng số Michaelis (Km) của phytase của activity in animal feed, J. Anim. Sci., 83:<br /> chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km 1062-1067.<br /> 0,0313 mM cho thấy ái lực cao giữa phytase với 4. Lei X. G., Porres J. M., 2003. Phytase<br /> cơ chất sodium phyate. enzymology, application, and<br /> biotechnology, Biotechnology letters, 25:<br /> Trọng lượng phân tử phytase của<br /> 1787-1794.<br /> Sporobolomyces japonicus (L9) là 36,9 KDa.<br /> 5. Oh B. C., Choi W. C., Kim Y. O., Oh T. K.,<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 2004. Biochemical properties and substrate<br /> specificities of alkaline and histidine acid<br /> 1. Bollag D. M., Rozyck M. D., Edelstein S. J.,<br /> phytase, Applied Microbiology and<br /> 1991. Protein methods, Willey Liss, New<br /> Biotechnology, 63: 62-372.<br /> York, 415 pages.<br /> 6. Parvinder Kaur, G. Kunze, T.<br /> 2. Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun Satyanarayana, 2007. Yeast Phytase: present<br /> J., Lohscheidt M., Zelder O., 2005. scenario and future perspectives, Critical<br /> Biotechnological production and application Reviews in Biotechnology, 27: 93-109.<br /> <br /> <br /> ISOLATION AND PURIFICATION EXTRACELLULAR PHYTASE FROM<br /> Sporobolomyces japonicus (L9)<br /> <br /> Hoang Quoc Khanh1*, Ngo Duc Duy1, Dao Thi Thu Hien1 , Trinh Phong Van2<br /> (1)<br /> Institute of Tropical Biologty, VAST<br /> (2)<br /> Binh Duong University of Economics and Technology<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Phytase of the yeast Sporobolomyces japonicus (L9), isolated from Cat Tien National Forest, was<br /> cultivated in modified YPD medium with activity of 2.720 UI/ml and optimal temperature and pH of 400C<br /> and 4.0. A suitable precipitation agent is ethanol 96% with specific activity of 312.924 UI/mg protein. Ca2+<br /> ion with 1mmol/ml reduced enzyme activity to 97% and Mn2+ with 5 mmol/mlreduced enzyme activity to<br /> 98%. Specific activity for peak 1 was 187.942 UI/mg protein and for peak 2-286.388 UI/mg protein. Total<br /> specific activity increased 1.8 times before chromatography work. Recovery efficiency of protein was 95.05%<br /> and recovery activity - 90.75%. The Michaelis-Menten constant (Km) was 0.0313 µM. The purified phytase<br /> had a molecular weight of 36.90 kDa.<br /> Keywords: Sporobomyces japonicus, phytase, specific activity, Ca2+, Mn2+, Km.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 98<br />