XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN<br />
TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN<br />
ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHÔ B CỦA CHUỘT LOU<br />
Phan Ngọc Tiến*<br />
<br />
TÓMTẮT<br />
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể<br />
đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP).<br />
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm.<br />
Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng<br />
kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F,<br />
có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml. Nghiên cứu định lượng AFP trong 90 mẫu<br />
huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có<br />
HBsAg (+), 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân<br />
u gan. Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh<br />
nhân u gan là > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%).<br />
Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP được sản xuất từ chuột<br />
LOU có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml.<br />
<br />
ABSTRACT<br />
THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTIALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT<br />
Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 208 - 212<br />
Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using<br />
monoclonal antibodies.<br />
Method: Experimental research.<br />
Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal<br />
antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml.<br />
In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples<br />
of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B<br />
hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8<br />
ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP<br />
< 500 ng/ml (24%), respectively.<br />
Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal<br />
antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml.<br />
nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận<br />
ĐẶTVẤNĐỀ<br />
diện và định lượng kháng nguyên.<br />
Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng<br />
được Georges Kohler và César Milstein trình<br />
bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng<br />
thể đơn dòng đã được ứng dụng trong rất<br />
<br />
Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có<br />
trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, được<br />
tổng hợp ở gan phôi thai và túi ối, vì vậy nồng độ<br />
AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh<br />
<br />
* Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP. Hồ Chí Minh<br />
209<br />
<br />
bào thai người rất cao. Tuy nhiên AFP có trong<br />
huyết thanh người sau sinh và người trưởng<br />
thành rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml(7,9,11).<br />
Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên<br />
phát AFP tăng rất cao, và việc định lượng AFP<br />
trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh<br />
ung thư gan nguyên phát.<br />
Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, được<br />
sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã<br />
mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng<br />
tôi xây dựng hệ thống định lượng AFP trong<br />
huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA(5,10).<br />
<br />
Mục tiêu nghiên cứu<br />
Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng<br />
kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế<br />
bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với<br />
AFP và dòng tế bào IR983.<br />
<br />
ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br />
Thiết kế nghiên cứu<br />
Nghiên cứu thực nghiệm.<br />
<br />
Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu<br />
- Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể<br />
đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase.<br />
- Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại<br />
Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế<br />
và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh.<br />
Trong đó 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân<br />
có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan, trong<br />
đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của<br />
bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu vi B<br />
cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14<br />
mẫu huyết thanh có HBsAg (+) nhưng không<br />
có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam – 4 nữ,<br />
35 mẫu huyết thanh của người bình thường<br />
khỏe mạnh, HBsAg (-).<br />
<br />
Phương pháp thu thập số liệu<br />
- Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai<br />
đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang<br />
tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA.<br />
<br />
350, 400, 500 ng/ml. Chúng tôi sử dụng AFP tinh<br />
chế và chuẩn độ của Viện Pasteur Tp. HCM.<br />
- Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể<br />
định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ<br />
chuột LOU: dùng phương pháp ELISA<br />
- Xác định mật độ quang tương ứng của các<br />
nồng độ thấp của AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5<br />
ng/ml. Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có<br />
thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ<br />
chuột LOU với phương pháp ELISA.<br />
- Định lượng AFP trong các mẫu huyết<br />
thanh bằng hệ thống định lượng sử dụng<br />
kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng<br />
phương pháp ELISA.<br />
Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh<br />
số thứ tự từ 1 đến 90, trong đó 35 mẫu huyết<br />
thanh của người bình thường được đánh số từ<br />
1 đến 35, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân<br />
có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến 49, 16<br />
mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu<br />
vi B cấp được đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu<br />
huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh<br />
số từ 66 đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định<br />
lượng không pha loãng, lần 2 những mẫu<br />
huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1<br />
sẽ được pha loãng với tỉ lệ 1:2. Những mẫu<br />
huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên<br />
350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả<br />
cuối cùng là trên 500 ng/ml.<br />
<br />
Xử lý số liệu<br />
Chương trình Point To Point, chương trình<br />
dùng cho xử lý số liệu trong kỹ thuật Elisa để<br />
tính kết quả định lượng nồng độ AFP. Chương<br />
trình SPSS 11.5<br />
<br />
KẾTQUẢ<br />
Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng<br />
độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng<br />
Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy<br />
khi nồng độ AFP tăng thì DO cũng tăng theo.<br />
Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500<br />
ng/ml thì DO tăng không đáng kể.<br />
<br />
- Xác định mật độ quang tương ứng của các<br />
nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300,<br />
210<br />
<br />
Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng<br />
nồng độ AFP trong huyết thanh đến mức cao<br />
nhất là 350ng/ml.<br />
<br />
+ Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng:<br />
y = a + bx, trong đó:<br />
Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính<br />
là: y = 0,599 + 0,0055x<br />
<br />
Qua đường cong chuẩn của hệ thống định<br />
lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng<br />
kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng<br />
tôi nhận thấy hai đại lượng DO và nồng độ<br />
AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận.<br />
<br />
+ P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan<br />
tuyến tính theo chiều thuận giữa hai đại lượng<br />
DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương<br />
quan có ý nghĩa thống kê.<br />
<br />
DO<br />
<br />
+ r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và<br />
nồng độ AFP có mối liên hệ thuận rất chặt chẽ.<br />
3,0<br />
<br />
2,5<br />
<br />
2,0<br />
<br />
8<br />
<br />
9<br />
<br />
300<br />
<br />
350<br />
<br />
7<br />
<br />
6<br />
5<br />
<br />
1,5<br />
4<br />
1,0<br />
3<br />
,5<br />
2<br />
1<br />
0,0<br />
0<br />
<br />
50<br />
<br />
100<br />
<br />
150<br />
<br />
200<br />
<br />
250<br />
<br />
400<br />
<br />
450<br />
<br />
500<br />
<br />
AFP (ng/ml)<br />
<br />
DO<br />
<br />
Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou<br />
,30<br />
<br />
,25<br />
8<br />
,20<br />
<br />
7<br />
<br />
,15<br />
6<br />
,10<br />
<br />
5<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3 4<br />
<br />
,05<br />
<br />
0,00<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
AFP (ng/ml)<br />
<br />
Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP<br />
độ AFP giảm thì giá trị DO giảm theo, nhưng<br />
Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ<br />
khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn<br />
thống định lượng AFP dựa trên kháng thể<br />
đi ngang. Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống<br />
đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể<br />
định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng<br />
định lượng được (đồ thị 2)<br />
kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng<br />
Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng<br />
211<br />
<br />
được là 0,5 ng/ml.<br />
<br />
KẾTLUẬN<br />
<br />
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các<br />
mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng<br />
AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP<br />
của chuột LOU<br />
<br />
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein<br />
bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn<br />
dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào<br />
lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP<br />
và dòng tế bào IR983, có thể định lượng nồng<br />
độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến<br />
350ng/ml.<br />
<br />
Số thứ tự Số mẫu Giá trị Giá trị lớn<br />
Giá trị<br />
mẫu huyết huyết nhỏ nhất<br />
nhất<br />
trung bình<br />
thanh<br />
thanh<br />
1-35<br />
35<br />
1,08<br />
7,26<br />
2,7780<br />
36-49<br />
14<br />
0,91<br />
6,08<br />
3,7993<br />
50-65<br />
16<br />
6,2<br />
113,53<br />
32,1806<br />
<br />
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br />
bệnh nhân u gan (những mẫu huyết thanh từ<br />
số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6<br />
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).<br />
<br />
BÀNLUẬN<br />
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein<br />
trong huyết thanh người bằng phương pháp<br />
Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản<br />
xuất từ tế bào lymphô B của chuột Lou và<br />
dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ<br />
đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở<br />
nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml so với hệ thống<br />
định lượng của các hãng khác là Abbott<br />
0,4ng/ml(2) và Maxim Biotech 2ng/ml(6), và<br />
AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao<br />
nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là<br />
350ng/ml(2) và Maxim Biotech là 300mg/ml(6).<br />
Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các<br />
thử nghiệm đặc tính và định lượng không có<br />
phản ứng chéo với các protein của huyết thanh<br />
nhất là với albumin, protein có trọng lượng<br />
phân tử và cấu trúc gần giống với AFP.<br />
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90<br />
mẫu huyết thanh có kết quả tương đồng với<br />
các nghiên cứu trong và ngoài nước(2,6,8).<br />
Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng<br />
kháng thể đơn dòng được sản xuất từ chuột<br />
Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết<br />
thanh từ 0,5-350ng/ml, và chúng tôi hy vọng<br />
góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ<br />
thống định lượng AFP.<br />
<br />
Mật độ quang và nồng độ AFP có mối<br />
quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p =<br />
0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x:<br />
nồng độ AFP chuẩn).<br />
Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ<br />
thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn<br />
dòng kháng AFP của chuột LOU<br />
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br />
người bình thường là 2,8 ng/ml.<br />
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br />
bệnh nhân có HBsAg(+) là 3,8 ng/ml.<br />
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br />
bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp là 32,1 ng/ml.<br />
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br />
bệnh nhân u gan đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6<br />
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).<br />
Cám ơn: GS.TS. Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp. HCM,<br />
BS. Cao Đức Trùng Dương và BS. Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ<br />
Dũ Tp. HCM đã giúp thực hiện nghiên cứu này.<br />
<br />
TÀILIỆUTHAMKHẢO<br />
1.<br />
<br />
2.<br />
3.<br />
4.<br />
5.<br />
6.<br />
<br />
7.<br />
<br />
8.<br />
<br />
Abbas AK., Lichtman AH., Jordan S.poder (1994), Cellular<br />
snd Molecular Immunology, W.B. Sauders Company, A<br />
division of Harcourt Brace Company, USA.<br />
Abbott laborarories Dignostics division (1992), In tumor<br />
marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8.<br />
Bazin H (1990), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal<br />
Antobody, CRC Press, USA.<br />
Harrison’s (1993), Principles of internal medicine, 12th<br />
Edition, Vol 2, pp.1381-1383.<br />
Kemeny D.M. (1991), A practiceal guide to Elisa, Department<br />
of Allergy Guy’s Hospital, London.<br />
Maxim Biotech (2006), “Alpha-fetoprotein Enzyme<br />
Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA,<br />
USA.<br />
Nguyễn Cao Cương (2000), “Tầm sóat ung thư gan<br />
nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4),<br />
tr.24-28.<br />
Nguyễn Kim Lữ Hiếu, Lê Văn Đôn (1996), “Nồng độ<br />
Alpha-fetoprotein ở 37 bệnh nhân được chẩn đoán lâm<br />
sàng là viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr.<br />
1-3.<br />
<br />
212<br />
<br />
9.<br />
10.<br />
11.<br />
<br />
Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học<br />
tập 1, nhà xuất bản tự điển bách khoa, Hà Nội, tr. 303-306.<br />
Tijssen P. (1985), Practice and Theory of enzyme<br />
immunoassays, Elsevier, The Netherlands.<br />
Trần Thị Chính, Phan Thị Phi Phi, Trương Mộng Trang<br />
(1993), “Đánh giá khả năng chẩn đoán ung thư gan của<br />
Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35.<br />
<br />
213<br />
<br />