Xây dựng quy trình định lượng glucosamin bằng phương pháp HPCL với đầu dò PDA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMIN<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA<br /> Nguyễn Lục Thơ*, Nguyễn Thị Chung**, Nguyễn Đức Tuấn***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Hiện nay, glucosamin đã được Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA) xếp vào danh<br /> mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp.Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn<br /> nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một<br /> quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh.<br /> Glucosamin được định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo, đầu dò PDA. Trong quá trình thực nghiệm, các<br /> yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đãđược khảo sát như tốc độ dòng, thành<br /> phần và tỷ lệ dung môi pha động.<br /> Kết quả: Đã xây dựng được quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC, sử<br /> dụng cột Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm acetonitril – đệm phosphat pH 3 có triethylamin<br /> (35:65, tt/tt), bước sóng phát hiện 195 nm, tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định<br /> lượng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng từ 600 – 1400 µg/ml, độ đúng thể hiện qua tỷ lệ hồi phục nằm<br /> trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác.<br /> Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng glucosamin. Quy trình đã được áp<br /> dụng để định lượng glucosamin trong viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong thử nghiệm độ<br /> hòa tan.<br /> Từ khóa: Glucosamin, sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE DETERMINATION OF GLUCOSAMINE<br /> BY HPLC WITH PDA DETECTOR<br /> Nguyen Luc Tho, Nguyen Thi Chung, Nguyen Duc Tuan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 157 - 161<br /> Objective: Currently, glucosamine has been approved as a drug for improving arthritis by the European<br /> Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA). The aim of the study was to develop a HPLC-PDA<br /> method for quantitative determination of glucosamine.<br /> Subjects and Methods: The subject of this study was glucosamine sulfate 750 mg fast-release coated-film<br /> tablets. Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the<br /> column efficiency and selectivity.<br /> Results: The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of<br /> glucosamine, using an Ascentic RP C8 column (250 x 4.6 mm; 5 μm), mixture of acetonitrile and phosphate<br /> buffer pH 3.0 containing triethylamine (35:65, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 0.5 ml/min., and<br /> detection wavelength of 195 nm. The method was shown high selectivity, wide linearity range from 600 to 1,400<br /> *<br /> <br /> **<br /> Sở Y tế Đồng Nai<br /> Hội Dược học TP. Hồ Chí Minh<br /> ***<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Lục Thơ - ĐT: 0913799068 -- Email:diemnhim@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> 157<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> μg mL−1. Intra-day relative standard deviation was below 2% and the recovery range was 98% - 102%.<br /> Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully developed for quantitative<br /> determination of glucosamine. The validated method was applied for quantitative determination of glucosamine in<br /> glucosamine sulfate 750 mg fast-release tablet, and of glucosamine released from dissolution test.<br /> Key words: Glucosamine, HPLC.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh xương khớp đang là vấn đề lớn của xã<br /> hội vì nó có thể làm người bệnh tàn phế, suy<br /> giảm sức lao động. Trong nhiều thập niên qua,<br /> việc điều trị viêm khớp chủ yếu là dùng các<br /> thuốc kháng viêm giảm đau nhằm mục đích<br /> giảm các triệu chứng đau và hạn chế vận động<br /> khớp viêm cho người bệnh.Tuy nhiên những<br /> thuốc này có rất nhiều tác dụng phụ và thường<br /> không cải thiện được tình trạng bệnh lý của sụn<br /> khớp bị hư hỏng. Theo khuyến cáo của Cơ quan<br /> đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA),<br /> glucosamin được xem là thuốc có hiệu quả và có<br /> nhiều ưu điểm hơn các thuốc kháng viêm nonsteroid do có rất ít tác dụng phụ. Đặt mối quan<br /> tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn<br /> nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt<br /> chất này, vì vậy đề tài này được thực hiện nhằm<br /> mục đích đưa ra một quy trình định lượng<br /> glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử<br /> độ hòa tan.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg<br /> (tương đương với glucosamin sulfat kali clorid<br /> 1000 mg) giải phóng nhanh, số lô: 121009, hạn<br /> dùng: 10/2012, nhà sản xuất: Ampharco (USA).<br /> <br /> Trang thiết bị, hóa chất, dung môi<br /> Trang thiết bị<br /> Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters<br /> Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996. Cân<br /> phân tích Sartorius BP221S. Máy đo pH<br /> Metrohm 744. Bể siêu âm Elma.<br /> Hóa chất, dung môi<br /> Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký<br /> lỏng (Merck).Acid phosphoric, kali hydroxyd,<br /> <br /> 158<br /> <br /> triethylamin đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Dựa vào cấu trúc glucosamin là một base<br /> hữu cơ và tham khảo chuyên luận glucosamin<br /> trong Dược điển Việt Nam IV (1), kỹ thuật sắc ký<br /> lỏng pha đảo được áp dụng với pha động bao<br /> gồm dung dịch đệm phosphat pH 3 và<br /> acetonitril, sắc ký đồ được ghi tại bước sóng 195<br /> nm. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh<br /> hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của<br /> phương pháp đã được khảo sát như tốc độ dòng,<br /> tỷ lệ dung môi pha động, thêm vào pha động<br /> triethylamin (TEA) để cải thiện hệ số đối xứng<br /> của pic glucosamin. Sau khi tìm được điều kiện<br /> sắc ký thích hợp, sẽ tiến hành thẩm định quy<br /> trình theo hướng dẫn của ICH (2), bao gồm khảo<br /> sát tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc,<br /> khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Sau<br /> khi được thẩm định, quy trình này sẽ được ứng<br /> dụng để định lượng glucosamin trong viên<br /> glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và<br /> trong thử nghiệm độ hòa tan.<br /> <br /> Chuẩn bị mẫu và dung dịch đệm<br /> Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác 100 mg<br /> glucosamin HCl, cho vào bình định mức 100 ml.<br /> Thêm khoảng 65 ml nước, siêu âm 5 phút. Thêm<br /> nước vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc<br /> 0,45µm.<br /> Dung dịch mẫu thử:Lấy 20 viên bao phim bất<br /> kỳ, lột bỏ màng bao, cân khối lượng viên nhân,<br /> nghiền mịn, trộn đều, tính khối lượng trung bình<br /> 1 viên nhân. Cân chính xác một lượng bột thuốc<br /> tương ứng 125 mg glucosamin sulfat kali clorid,<br /> cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml nước,<br /> siêu âm 10 phút. Thêm nước đến vạch, lắc đều,<br /> lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Lọc tiếp qua màng lọc<br /> 0,45 µm.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> Mẫu trắng: Mẫu trắng 1: pha động; Mẫu<br /> trắng 2: mẫu giả dược (chuẩn bị tương tự dung<br /> dịch mẫu thử nhưng không có glucosamin).<br /> Dung dịch đệm phosphat pH 3: lấy chính xác<br /> 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc, pha loãng trong<br /> 1000 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 3 bằng<br /> dung dịch kali hydroxyd 30%, lọc qua màng lọc<br /> 0,45 µm.<br /> Dung dịch đệm phosphat pH 3 có triethylamin:<br /> lấy chính xác 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc,<br /> pha loãng trong 1000 ml nước cất, điều chỉnh<br /> đến pH 3 bằng dung dịch kali hydroxyd 30%,<br /> thêm tiếp 2,1 ml triethylamin, tiếp tục điều chỉnh<br /> đến pH 3 bằng dung dịch acid phosphoric 1%,<br /> lọc qua màng lọc 0,45 µm.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Thăm dòđiều kiện sắc ký<br /> Trong các điều kiện sắc ký khảo sát, hai điều<br /> kiện ảnh hưởng đến thời gian lưu và hệ số đối<br /> xứng của pic glucosamin được trình bày trong<br /> bảng 1. Hình 1 và hình 2 minh họa sắc ký đồ của<br /> dung dịch mẫu chuẩn khi tiến hành sắc ký theo<br /> hai điều kiện này.<br /> Bảng 1: Hai điều kiện sắc ký khảo sát<br /> Pha động<br /> <br /> Thời gian lưu<br /> (phút)<br /> Hệ số đối xứng<br /> pic glucosamin<br /> <br /> Điều kiện 1<br /> Điều kiện 2<br /> Acetonitril: đệm<br /> Acetonitril: đệm<br /> phosphat pH 3<br /> phosphat pH 3 có<br /> (35:65, tt/tt)<br /> triethylamin (35:65, tt/tt)<br /> 5,173<br /> 5,216<br /> 1,6<br /> <br /> 1,2<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện 1.<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện 2.<br /> Nhận xét: Thời gian lưu của glucosamin hầu<br /> như không thay đổi ở cả 2 điều kiện. Với điều<br /> kiện 1, hệ số đối xứng của pic glucosamin có giá<br /> trị 1,6. Với điều kiện 2 (có thêm TEA), hệ số đối<br /> xứng được cải thiện đáng kể, có giá trị 1,2. Như<br /> vậy điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng<br /> glucosamin sulfat kali clorid như sau:<br /> <br /> TEA: acetonitril (65:35, tt/tt)<br /> Cột sắc ký: Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5<br /> µm)<br /> Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút<br /> Đầu dò PDA: 195 nm<br /> Thể tích bơm mẫu: 10 µl<br /> <br /> Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 3 có<br /> <br /> Thẩm định phương pháp<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> 159<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Khảo sát tính phù hợp của hệ thống<br /> Bảng 2:Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6)<br /> Mẫu<br /> Chuẩn<br /> <br /> Thử<br /> <br /> Giá trị thống kê<br /> Trung bình<br /> SD<br /> RSD<br /> Xtb<br /> SD<br /> RSD<br /> <br /> tR (phút)<br /> 5,204<br /> 0,003<br /> 0,05%<br /> 5,033<br /> 0,002<br /> 0,05%<br /> <br /> S (µAU x giây)<br /> 1318685<br /> 8515<br /> 0,65%<br /> 1043176<br /> 13391<br /> 1,28%<br /> <br /> As<br /> 1,2<br /> 0,0<br /> 0,51%<br /> 1,2<br /> 0,0<br /> 1,17%<br /> <br /> N<br /> 11756<br /> 18<br /> 0,62%<br /> 11628<br /> 42<br /> 1,46%<br /> <br /> tR: thời gian lưu, S: diện tích pic, As: hệ số đối xứng, N: số đĩa lý thuyết<br /> <br /> đồng thời mẫu trắng và mẫu giả dược không có<br /> pic trùng với pic glucosamin. Khi thêm một<br /> lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện<br /> tích pic glucosamin tăng lên so với trước khi<br /> thêm chuẩn.Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic<br /> glucosamin trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại<br /> thời gian lưu của pic glucosamin trong mẫu<br /> chuẩn. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết<br /> pic của đầu dò PDA cho thấy pic glucosamin<br /> không có các thành phần khác trong tất cả các<br /> mẫu. Như vậy, qui trình định lượng glucosamin<br /> có tính chọn lọc.<br /> <br /> Nhận xét: Hệ số đối xứng có giá trị trung bình<br /> trong khoảng 0,8 – 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối<br /> (RSD) của các thông số sắc ký cho các lần tiêm<br /> lặp lại của mẫu chuẩn và mẫu thử đều nhỏ hơn<br /> 2%.Vậy quy trình định lượngglucosamin đạt<br /> tính phù hợp của hệ thống.<br /> <br /> Tính chọn lọc<br /> Hình 3 minh họa sắc ký đồ pha động, mẫu<br /> giả dược, mẫu chuẩn và mẫu thử. Kết quả khảo<br /> sát tính chọn lọc cho thấy: thời gian lưu của pic<br /> hoạt chất trong mẫu thử tương đương với thời<br /> gian lưu của pic glucosamin trong mẫu chuẩn,<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (d)<br /> <br /> Hình 3:Sắc ký đồ pha động (a), mẫu giả dược (b) mẫu chuẩn (c), mẫu thử (d).<br /> 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác.<br /> Độ đúng, độ chính xác và khoảng tuyến<br /> Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác và<br /> tính<br /> khoảng tuyến tính<br /> Kết quả thống kê cho thấy qui trình phân<br /> tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương<br /> quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% -<br /> <br /> 160<br /> <br /> Chỉ tiêu thẩm định<br /> Phương trình hồi qui<br /> <br /> Giá trị thống kê<br /> 2<br /> y = 1379,5x – 59340; R =<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Khoảng tuyến tính (µg/ml)<br /> Độ lặp lại (n=6)<br /> Độ chính xác liên ngày (n=18)<br /> Độ đúng (tỷ lệ hồi phục, n=9)<br /> <br /> 0,9999<br /> 600 - 1400<br /> RSD = 1,71%<br /> RSD = 0,45%<br /> 99,9% - 101,1 %<br /> <br /> Ứng dụng quy trình định lượng<br /> glucosamin trong viên nén glucosamin<br /> sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong<br /> thử nghiệm độ hòa tan<br /> Quy trình phân tích sau khi thẩm định đã<br /> được ứng dụng để định lượng glucosamin sulfat<br /> kali clorid trong 3 lô pilot và trong thử nghiệm<br /> độ hòa tan sau 10 phút.<br /> Glucosamin sulfat kali clorid được hòa tan<br /> trên 85% sau 10 phút ở cả 3 lô thuốc.Với chỉ tiêu<br /> định lượng, cả 3 lô đều có hàm lượng<br /> glucosamin sulfat kali clorid nằm trong khoảng<br /> từ 90% - 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn.<br /> Bảng 4: Kết quả định lượng và thử nghiệm độ hòa<br /> tan trên 3 lô thành phẩm (n=6)<br /> Chỉ tiêu<br /> <br /> Phần trăm glucosamin sulfat kali clorid so<br /> với nhãn<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Độ hòa tan<br /> Định lượng<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Lô 1<br /> 91,39%<br /> 99,59%<br /> <br /> Lô 2<br /> 91,36%<br /> 99,72%<br /> <br /> Lô 2<br /> 91,12%<br /> 101,33%<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng<br /> cao với đầu dò dãy diod quang, chúng tôi đã xây<br /> dựng được quy trình định lượng glucosamin.<br /> Phương pháp đạt tính phù hợp của hệ thống, có<br /> tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng cao,<br /> khoảng tuyến tính rộng.Quy trình này có thể<br /> được ứng dụng để định lượng glucosamin trong<br /> chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> 2.<br /> <br /> Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học,<br /> Hà Nội, 289-292.<br /> ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of<br /> analytical proceduces: text and methodology, 1-13.<br /> <br /> Ngày nhận bài báo:<br /> <br /> 10.12.2012<br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013<br /> Ngày bài báo được đăng:<br /> <br /> 10.03.2014<br /> <br /> 161<br /> <br />