Xây dựng quy trình định lượng polysacharid trong cao mã đề bằng phương pháp đo quang

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG POLYSACHARID TRONG CAO MÃ ĐỀ BẰNG<br /> PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG<br /> Lê Thị Lan Phương∗, Lâm Ngọc Thọ∗∗, Nguyễn Ngọc Khôi**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Mã ñề Plantago major L. ñược sử dụng với nhiều mục ñích trong Y học cổ truyền<br /> trên toàn thế giới. Tuy vậy, cho ñến nay tại Việt Nam, việc sử dụng cao Mã ñề trong các chế phẩm trị liệu còn<br /> rất hạn chế, một phần có thể do cao Mã ñề chưa có tiêu chuẩn xây dựng ñể ñịnh lượng.<br /> Xây dựng phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần bằng phương pháp so màu, sử dụng acid D<br /> (+) galacturonic làm chất chuẩn.<br /> Phương pháp: Polysaccharid ñược chiết từ cao toàn phần bằng nước nóng, sau ñó làm tủa<br /> polysaccharid bằng ethanol 95%. Tủa này cho phản ứng với dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc. Sau<br /> ñó hòa tan trong ethanol 95%. Đo sản phẩm tạo thành bằng máy ño quang phổ UV-Vis ở cực ñại hấp thu<br /> 422 nm. Phản ứng ñược thực hiện song song với acid D (+) galacturonic chuẩn.<br /> Kết quả: Kết quả thẩm ñịnh qui trình cho thấy có thể ứng dụng ñể ñịnh lượng polysaccharid trong cao<br /> chiết mã ñề.<br /> Kết luận: Xây dựng và thẩm ñịnh qui trình ñịnh lượng polysaccharid toàn phần trong cao mã ñề, sử<br /> dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn.<br /> Từ khóa: Mã ñề Plantago major L., polysaccharid, acid D (+) galacturonic.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE ANALYSIS OF POLYSACCHARIDES FROMPLANTAGO MAJOR EXTRACT<br /> Le Thi Lan Phuong, Lam Ngoc Tho, Nguyen Ngoc Khoi<br /> Background and aims: Plantago major L. has been used as a medicinal material for many years. The<br /> biological activity of this type of plant material is due to a complex of biologically active compounds in<br /> which the polysaccharides are particularly noteworthy. The present study was undertaken to develop and<br /> validate quantitative method for analysis the total content of polysaccharides in Plantago major extracts.<br /> Methods: The polysaccharides from P. major extracts were developed by Dreywood method, converted<br /> to galacturonic acid.<br /> Results: This quantitative determination is inexpensive, simple, sensitive, and reproducible.<br /> Conclusion: This method is appliable to determine the polysaccharide content of Plantago major<br /> extracts.<br /> Key words: Plantago major L., polysaccharide, D (+) galacturonic acid, quantitative analysis<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Mã ñề Plantago major L. ñược sử dụng với nhiều mục ñích trong Y học cổ truyền trên toàn thế giới như<br /> có tác dụng tốt ñối với bệnh lao, ung thư và ñặc biệt ñối với các thể nặng của loét dạ dày. Cao chiết từ lá khô<br /> có tác dụng kích thích sự tái sinh tất cả các lớp của da, tác dụng lợi tiểu, làm tăng lượng nước tiểu, ure, acid<br /> uric và muối trong nước tiểu. Cao cồn có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt ñối với tổn thương gan gây bởi CCl4<br /> trên ñộng vật. Hoạt chất aucubin phân lập từ hạt mã ñề có tác dụng bảo vệ gan và chống ngộ ñộc nấm<br /> Amanita [1],[3],[5],[6].Tuy vậy, cho ñến nay tại Việt Nam, việc sử dụng cao mã ñề trong các chế phẩm có mục<br /> ñích trị liệu còn rất hạn chế, một phần là do cao mã ñề chưa có tiêu chuẩn xây dựng ñể ñịnh lượng. Trong<br /> nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần bằng phương pháp so<br /> màu sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn theo phương pháp của D. N. Olennikov [4].<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Hóa chất, dung môi:<br /> Dung môi sử dụng chiết xuất là loại dược dụng, dung môi và hóa chất dùng trong phân tích, ñịnh lượng<br /> dùng loại PA (Pure Analysis) hoặc AR (Analysis Reagent): anthron PA (Merck), acid sulfuric PA, acid<br /> hydrocloric PA (Prolabo), acid D (+) galacturonic PA (Fluka-Slovakia), ethanol PA (Merck),<br /> Thiết bị:<br /> Máy ño quang phổ UV-Vis Hitachi U-1900, máy ly tâm Sigma<br /> <br /> ∗<br /> <br /> Khoa Y học Cổ Truyền- Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> Khoa Dược – Đại học y Dược Tp. HCM<br /> Địa chỉ liên hệ: DS. Lê Thị Lan Phương<br /> ĐT:0907748591<br /> ∗∗<br /> <br /> Email: lanphuongd04@yahoo.com<br /> <br /> 147<br /> <br /> Cao chiết Mã ñề:<br /> Thu mua Mã ñề còn tươi vào tháng 03/2009 tại chợ Nguyễn Văn Trỗi, loại bỏ những thân, lá bị sâu<br /> bệnh, rửa sạch, bỏ rễ, phơi âm can và xay thô. Bột Mã ñề sau ñó ñược ngấm kiệt bằng cồn 50% với tỷ lệ<br /> dung môi: dược liệu là 10:1. Tất cả dịch chiết sau ñó ñược cô cách thủy ñến khi ñược cao chiết với ñộ ẩm<br /> 12,43%, hiệu suất chiết sau khi ñã trừ ẩm là 20%.<br /> Phương pháp xử lý mẫu:<br /> Cân chính xác khoảng 1 g cao cho vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước nóng. Đun cách thủy trong 1 giờ,<br /> làm lạnh. Lọc vào bình ñịnh mức 50 ml. Thêm khoảng 20 ml nước nóng và chiết thêm 1 lần nữa trong ñiều<br /> kiện tương tự. Bổ sung nước cho tới vạch (dung dịch A).<br /> Lấy 2 ml dung dịch A, thêm 4 ml ethanol 95%, khuấy ñều và cách thủy 10 phút. Sau ñó ñể nguội và ly<br /> tâm 3000 vòng/10 phút. Gạn bỏ dịch. Thêm vào tủa 5 ml ethanol 95%, tiến hành các bước tương tự như trên.<br /> Sau khi ly tâm bỏ dịch, dùng hơi nóng loại bỏ vết của ethanol. Thêm 4 ml dung dịch 0,2% anthron/H2SO4<br /> ñậm ñặc, ñem cách thủy hỗn hợp phản ứng trong 10 phút. Để nguội, cho vào bình ñịnh mức 25 ml, bổ sung<br /> ethanol 95% ñến vạch (dung dịch B).<br /> Mẫu chuẩn ñược thực hiện ñồng thời với mẫu thử khi cho phản ứng với dung dịch 0,2% anthron/H2SO4<br /> ñậm ñặc. Dung dịch mẫu trắng là 4 ml dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc trong bình ñịnh mức 25 ml,<br /> bổ sung ethanol 95% ñến vạch.<br /> Quét phổ mẫu thử và mẫu chuẩn từ 700 – 350 nm tìm ñỉnh hấp thu cực ñại ñể tiến hành ñịnh lượng.<br /> Thẩm ñịnh qui trình:<br /> Bao gồm: khảo sát ñộ lặp lại, ñộ chính xác của phương pháp và khoảng tuyến tính của nồng ñộ ñịnh<br /> lượng. Từ ñó suy ra lượng polysaccharid toàn phần có trong cao chiết quy về acid D (+) galacturonic.<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Phổ UV-Vis tìm bước sóng hấp thu cực ñại<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> Hình 1. Bước sóng hấp thu cực ñại của chuẩn và mẫu thử<br /> Mẫu chuẩn (1) và thử (2) có ñỉnh hấp thu cực ñại ở bước sóng 422 nm, vì thế chọn bước sóng này ñể<br /> ñịnh lượng. Theo tác giả D. N. Olennikov thì mẫu chuẩn và thử có ñỉnh hấp thu cực ñại là 424 nm [5]<br /> Khoảng tuyến tính<br /> Khảo sát sự tuyến tính giữa lượng acid D (+) galacturonic và ñộ hấp thu theo phương pháp tiến hành trên<br /> với lượng mẫu từ 160 – 560 µg, sau ñó sử dụng MS-Excel ñể phân tích hồi quy (regression analysis) ta có<br /> dạng ước tính của phương trình tương quan tuyến tính là Ŷ = 0,0014 X – 0,0085. Trắc nghiệm tính tương<br /> thích của phương trình và ý nghĩa của hệ số hồi quy cho thấy phương trình hồi quy tuyến tính giữa lượng<br /> acid D (+) galacturonic và ñộ hấp thu là Y = 0,0014X [2]<br /> Khoảng tuyến tính là 160 – 560 µg ñể tính lượng mẫu thử cần thiết cho ñịnh lượng, ñồng thời tiến hành<br /> thử ñộ ñúng và ñộ chính xác của qui trình trong khoảng tuyến tính này.<br /> <br /> 148<br /> <br /> Bảng 1. Sự tương quan giữa lượng acid D (+) galacturonic và ñộ hấp thu<br /> Lượng acid D (+) galacturonic (µg)<br /> (X)<br /> 160<br /> 240<br /> 320<br /> 400<br /> 480<br /> 560<br /> <br /> Độ hấp thu (Y)<br /> 0,208<br /> 0,307<br /> 0,44<br /> 0,543<br /> 0,632<br /> 0,753<br /> <br /> Độ chính xác:<br /> Bảng 2. Kết quả khảo sát ñộ chính xác<br /> Lần thử<br /> <br /> Độ hấp thu<br /> <br /> Hàm lượng (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,568<br /> <br /> 100,0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,564<br /> <br /> 99,29<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,567<br /> <br /> 99,82<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,562<br /> <br /> 98,94<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0,56<br /> <br /> 98,59<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0,563<br /> <br /> 99,12<br /> <br /> Trung bình X = 99,29 ; SD = 0,487 ; CV = 0,49%<br /> <br /> Kết quả khảo sát ñộ chính xác cho thấy qui trình ñịnh lượng polysaccharid trong mã ñề có ñộ chính xác<br /> cao (CV = 0,49% < 2%), ñáp ứng yêu cầu ñối với một phương pháp ñịnh lượng.<br /> Độ ñúng:<br /> Thực hiện bằng cách lần lượt thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn bằng 100% ± 10% hàm lượng chất<br /> có trong mẫu.<br /> <br /> Bảng 3. Kết quả khảo sát ñộ ñúng<br /> Lượng Lượng<br /> Tổng<br /> mẫu thêm (µg) lượng<br /> (µg)<br /> (µg)<br /> 207,5<br /> <br /> Độ hấp Lượng<br /> Tỷ lệ<br /> thu<br /> tìm thấy phục hồi<br /> (%)<br /> 0,282<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 160<br /> <br /> 367,5<br /> <br /> 0,493<br /> <br /> 150,7<br /> <br /> 94,1<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 160<br /> <br /> 367,5<br /> <br /> 0,495<br /> <br /> 152,1<br /> <br /> 95,1<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 160<br /> <br /> 367,5<br /> <br /> 0,498<br /> <br /> 154,2<br /> <br /> 96,4<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 190<br /> <br /> 397,5<br /> <br /> 0,550<br /> <br /> 191,4<br /> <br /> 100,8<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 190<br /> <br /> 397,5<br /> <br /> 0,545<br /> <br /> 187,8<br /> <br /> 98,9<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 190<br /> <br /> 397,5<br /> <br /> 0,546<br /> <br /> 188,6<br /> <br /> 99,2<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 224<br /> <br /> 431,5<br /> <br /> 0,587<br /> <br /> 217,9<br /> <br /> 97,3<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 224<br /> <br /> 431,5<br /> <br /> 0,578<br /> <br /> 211,4<br /> <br /> 94,4<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 224<br /> <br /> 431,5<br /> <br /> 0,590<br /> <br /> 220<br /> <br /> 98,2<br /> <br /> Trung bình: 97,16<br /> <br /> Qui trình ñịnh lượng có tỷ lệ phục hồi trung bình là 97,16% (ñạt yêu cầu khi từ 98-102%). Tỷ lệ phục hồi<br /> này có thể chấp nhận ñược vì ñây là qui trình ñịnh lượng dược liệu.<br /> Kết quả thẩm ñịnh qui trình cho thấy phương pháp vừa xây dựng trên có thể ứng dụng ñể ñịnh lượng<br /> polysaccharid trong cao chiết mã ñề.<br /> Hàm lượng polysaccharid<br /> Polysaccharid toàn phần có trong cao chiết ñược tính theo công thức sau:<br /> AC/AT = CC/CT<br /> Trong ñó: Nồng ñộ CC = 400 µg<br /> Độ hấp thu mẫu chuẩn AC = 0,543<br /> <br /> 149<br /> <br /> Độ hấp thu mẫu thử AT = 0,568<br /> CT = (0,568 x 400) /0,543 = 418,4 µg<br /> Từ CT tính % polysaccharid có trong cao chiết X = (CT x 25 )x(100/m)/106<br /> 25 là nồng ñộ pha loãng, 106 hệ số ñổi µg ra gam<br /> m lượng cân mẫu (1 gam)<br /> X= (418,4 x 25) x (100/1) / 106 = 1,046% tính theo cao toàn phần.<br /> Kết quả ñược lặp lại 3 lần, lấy số trung bình<br /> KẾT LUẬN<br /> Phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần trong cao mã ñề sử dụng acid D (+) galacturonic làm<br /> chất chuẩn xây dựng và thẩm ñịnh nêu trên cho thấy với phương pháp tương ñối ñơn giản, nhanh chóng từ<br /> cách xử lý mẫu ñến ñiều kiện phân tích, ñảm bảo tính tuyến tính, ñộ ñúng và chính xác. Phương pháp này<br /> hoàn toàn có thể áp dụng trong việc ñịnh lượng cao chiết Mã ñề, nhằm tiêu chuẩn hóa các công thức có sử<br /> dụng cao Mã ñề trong mục ñích ñiều trị.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Chiang L.C., Chiang W., Chang M.Y., Ng. L.T., Lin. C.C. (2002), Antiviral activity of Plantago<br /> major extracts and related compounds in vitro, Antiviral Research, pp. 55, 53–62<br /> 2. Đặng Văn Giáp (2003),Trắc nghiệm giả thuyết trong nghiên cứu khoa học, ĐHYD Tp. HCM khoa<br /> Dược.<br /> 3. Lezama R.V., Aguilar R. T., Ramos R. R., Avila E. V., Gutiérrez M. P. (2006), Effect of Plantago major<br /> on cell proliferation in vitro, Journal of Ethnopharmacology, pp. 103, 36-42<br /> 4. Olennikov D.N., Tankhaeva L. M. and Samuelsen A. B. (2006), Quantitative analysis of<br /> polysaccharides from Plantago major leaves using the Dreywood method, Chemisty of Natural<br /> Compounds, 42, No. 3, pp. 265-268.<br /> 5. Samuelsen A.B,(2000),The traditional uses, chemical constituents and biological activitives of<br /> Plantago major L. A review, Journal of Ethnopharmacology, pp. 71, 1-21<br /> 6. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và ñộng vật làm thuốc Việt Nam, tập 1,NXB Khoa học kỹ thuật,<br /> Hà Nội, tr.345-349, 419-424.<br /> <br /> 150<br /> <br />