Xây dựng quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD) dùng trong đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng người

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ PHÂN TÁN NHIỄM SẮC CHẤT<br /> CỦA TINH TRÙNG (SPERM CHROMATIN DISPERSION - SCD)<br /> DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG NGƯỜI<br /> Nguyễn Trương Thái Hà*, Nguyễn Thị Thúy An*, Mã Phạm Quế Mai*, Phạm Nguyễn Thảo Trang*,<br /> Hồ Mạnh Tường*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng.<br /> Đối tượng: 70 mẫu tinh dịch của tình nguyện viên nam tuổi từ 18 - 40.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Các bước xây dựng quy trình gồm khảo sát: mật độ tinh trùng làm tiêu bản,<br /> thành phần dung dịch ly giải, thời gian ly giải và điều kiện biến tính trước ly giải. Mẫu tinh dịch xử lý H2O2 2%<br /> làm chứng dương. Hiệu quả của quy trình sẽ được đối chứng với kết quả từ bộ thuốc thử Halosperm® G2.<br /> Kết quả: Quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD)<br /> thực hiện với mật độ tinh trùng dùng làm tiêu bản là 106 tinh trùng/ml, sử dụng dung dịch biến tính là HCl<br /> 0.08N, một dung dịch ly giải gồm Tris 0.4M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5M, SDS 1%, EDTA 50mM, pH 7.5, thuốc<br /> nhuộm là DAPI 2µg/ml. Hiệu quả của quy trình cho kết quả tương quan dương mạnh (r = 0.97, p < 0.01) khi<br /> chạy thống kê SPSS ver.16 với bộ thuốc thử thương mại Halosperm®.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiện<br /> ngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu về<br /> phân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam.<br /> Từ khóa: Halosperm, hỗ trợ sinh sản, SCD, phân mảnh DNA tinh trùng, vô sinh nam.<br /> SUMMARY<br /> ESTABLISHING THE PROCEDURE SPERM CHROMATIN DISPERSION (SCD)<br /> FOR DETERMINATION OF HUMAN SPERM DNA FRAGMENTATION<br /> Nguyen Truong Thai Ha, Nguyen Thi Thuy An, Ma Pham Que Mai, Pham Nguyen Thao Trang,<br /> Ho Manh Tuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - No 5 - 2016: 82 - 87<br /> <br /> Objective: Establish the procedure for determination of human sperm DNA fragmentation<br /> Subjects: 70 semens from male volunteers in ages 18 - 40.<br /> Methods: The experiments were surveyed such as the optimal semen dilution for templates, semen dilution,<br /> the concentration of the components in the lysis solution and conditions for human sperm DNA treatment. The<br /> H2O2 2% treated semen was used as positive control. In addition, DFI was evaluated by both of the established<br /> procedure and the halo sperm G2 kit in order to assess correlation between two methods.<br /> Result: It is shown that the optimal sperm concentration is 106 sperm/ml. Samples should be treated in the<br /> denaturing solution HCl 0.08N before using lysis solution (Tris 0.4 M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5 M, SDS 1 %,<br /> EDTA 50 mM, pH 7.5). Sperm DNA was stained by fluorescence dye DAPI 2 µg/ml. And DFI can be analyzed<br /> on fluorescence microscopy at 40X. The strong positive correlation was observed to both of the improved SCD test<br /> and Halosperm kit (r=0.97, P50% ở cả 3 nhóm DFI. Ở nồng độ 0.4 mM và<br /> 0.6 mM kết quả DFI của mẫu tương đương với<br /> Khảo sát nồng độ DTT tối ưu 0.2 mM, 0.4<br /> Halosperm ở 3 nhóm DFI. Chọn nồng độ DTT<br /> mM, 0.6 mM, 0.8 Mm 0.4 mM để tiết kiệm hóa chất.<br /> Xét chứng dương: ở nồng độ 0.2 mM, 0.4<br /> Khảo sát nồng độ NaCl tối ưu 1M, 1.5M, 2M<br /> mM và 0.6 mM các mẫu đều cho kết quả DFI<br /> 100%, nồng độ 0.8mM các mẫu bị âm tính giả Xét chứng dương: ở cả ba nồng độ tất cả các<br /> vì chỉ cho kết quả DFI < 50%. Xét kết quả DFI mẫu đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả<br /> của các mẫu: ở nồng độ 0.2 mM kết quả từ quy DFI của các mẫu: ở nồng độ NaCl 1 M kết quả<br /> <br /> <br /> <br /> 85<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> từ quy trình SCD của mẫu bị dương tính giả, tỷ 37oC trộn đều và nhỏ toàn bộ lên lam kính, đậy<br /> lệ DFI >50% ở cả 3 nhóm DFI, nồng độ 1.5 M và phiến kính 24 x 60 mm lên trên để gel dàn đều.<br /> 2 M các mẫu đều cho kết quả tương đương Đặt lam mẫu vào tủ 4oC trong 5 phút. Tháo bỏ<br /> giữa quy trình SCD và Haosperm. Để tiết kiệm phiến kính. Ngâm lam mẫu vào dung dịch HCl<br /> hóa chất chọn nồng độ NaCl tối ưu là 1.5 M. 0,08N, trong 7 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển<br /> Cải tiến dung dịch ly giải lam mẫu ngâm vào dung dịch ly giải cải tiến,<br /> thành phần: Tris 0.4 M, DTT 0.4 mM, NaCl 1.5<br /> Xét chứng dương: cả 4 nghiệm thức đều<br /> M, SDS 1%, EDTA 50 mM, pH 7.5, trong 20<br /> cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả DFI của các<br /> phút ở 22oC. Rửa lam mẫu trong TBE 1X trong<br /> mẫu: ở mẫu chỉ sử dụng L1 hoặc L2 nhận thấy<br /> 5 phút. Lần lượt rửa lam mẫu trong EtOH 70%,<br /> mẫu không ly giải, 100% tinh trùng không có<br /> 90% và 100% trong 2 phút/lần rửa. Để lam kính<br /> halo, hình thái đầu không nở to. Mẫu ly giải<br /> mẫu khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, trải đều<br /> L1L2 và L2DTT trong 30 phút cho kết quả DFI<br /> 100 µl thuốc nhuộm DAPI 2 µg/ml lên lam<br /> tương đương Halosperm. Vậy dung dịch<br /> mẫu, ủ tối trong 20 phút. Lắc rửa lam kính mẫu<br /> L2DTT có tác dụng tương tự với việc sử dụng 2<br /> trong TBE 1X, để khô tự nhiên khoảng 20 phút<br /> dung dịch ly giải, xét về mặt hóa chất và thao<br /> trong tối. Phân tích tối thiểu 200 tế bào trên lam<br /> tác thì tiện lợi hơn nên sử dụng dung dịch ly<br /> mẫu trên kính hiển vi huỳnh quang vật kính<br /> giải kết hợp cho các bước thí nghiệm tiếp theo.<br /> 40X, tính DFI theo công thức.<br /> Kiểm tra thời gian ly giải mẫu trong dung<br /> Kiểm tra hiệu quả của quy trình SCD mới<br /> dịch L2DTT<br /> xây dựng<br /> Xét chứng dương: cả 3 thời gian, tất cả các<br /> Đánh giá tương quan kết quả DFI giữa quy<br /> mẫu đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả<br /> trình SCD và bộ thuốc thử Halosperm® cho kết<br /> DFI của các mẫu: mẫu thực hiện ly giải với<br /> quả tương quan dương mạnh có ý nghĩa thống<br /> dung dịch L2DTT 30 phút và 20 phút cho kết<br /> kê với r = 0.97, p < 0.001 (Biểu đồ 1)<br /> quả DFI tương đương với bộ thuốc thử<br /> Halosperm®, để tiết kiệm thời gian thực hiện<br /> chọn thời gian ngâm ly giải là 20 phút.<br /> Khảo sát điều kiện biến tính trước ly giải<br /> Xét chứng dương: mẫu không xử lý biến<br /> tính ngâm trong HCl 0.08 N trong 7 phút và có<br /> xử lý biến tính đều cho kết quả DFI 100%. Xét<br /> kết quả DFI của các mẫu: mẫu không xử lý biến<br /> tính bị dương tính giả cho DFI là 100%, mẫu xử<br /> lý biến tính cho kết quả DFI tương đương với<br /> bộ thuốc thử Halosperm®. Cần xử lý biến tính<br /> tinh trùng trước ly giải để biến tính DNA tinh<br /> Biểu đồ 1 Mối tương quan chỉ số DFI giữa quy<br /> trùng, bộc lộ các đứt gãy.<br /> trình SCD cải tiến và bộ thuốc thử Halosperm<br /> Quy trình SCD cải tiến<br /> KẾT LUẬN<br /> Phủ một lớp gel LMA 1% mỏng lên bề mặt<br /> lam kính, để khô ở nhiệt độ phòng. Pha loãng Nhóm nghiên cứu phân mảnh tinh trùng<br /> mẫu tinh dịch trong phosphate buffered saline thuộc trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức<br /> - PBS đến mật độ 106 tinh trùng/ml. Cho 25 µl khỏe Sinh sản (CGRH) đã thành công trong<br /> tinh dịch pha loãng vào 50µl gel LMA 1% ở việc xây dựng quy trình SCD chẩn đoán phân<br /> mảnh DNA tinh trùng người. Với các ưu điểm<br /> <br /> <br /> 86<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> như thao tác đơn giản, thời gian thực hiện 5. Evenson Donald, Lorna Jost (2000) Sperm chromatin<br /> structure assay is useful for fertility assessment. Methods in<br /> ngắn, chi phí hóa chất thấp (chỉ khoảng 1/5 so Cell Science, 22: 169 – 189.<br /> với giá thành nhập khẩu bộ thuốc thử 6. Fernández JL, Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosálvez J,<br /> Enciso M, LaFromboise M, De Jonge C (2005) Simple<br /> Halosperm), lại cho hiệu quả tương đương,<br /> determination of human sperm DNA fragmentation with an<br /> quy trình SCD có tiềm năng trở thành một xét improved sperm chromatin dispersion test. Fertil Steril, 84:<br /> nghiệm thường quy giúp đánh giá phân mảnh 833-842.<br /> 7. Fernández JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R,<br /> DNA tinh trùng, cùng với tinh dịch đồ góp Alvarez JG (2003) The sperm chromatin dispersion test: a<br /> phần chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn cho simple method for the determination of sperm DNA<br /> các bệnh nhân vô sinh nam. Bên cạnh đó, hiện fragmentation. J Androl, 24: 59–66.<br /> 8. García-Peiró A, Martínez-Heredia J, Oliver-Bonet M, Abad<br /> tại ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân mảnh C, Amengual MJ, Navarro J, Jones C, Coward K, Gosálvez J,<br /> DNA tinh trùng vẫn chưa có nhiều công bố. Do Benet J (2011) Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates<br /> with dynamic aspects of DNA fragmentation in human<br /> đó, với quy trình SCD cải tiến chúng tôi có thể<br /> sperm. Fertil Steril, 95: 105–109.<br /> mở ra thêm nhiều hướng nghiên cứu về phân 9. Gosalvez B, Fernandez JL, Goyanes V (2006) A method for<br /> mảnh DNA tinh trùng ứng dụng vào các kỹ determination of DNA fragmentation in animal sperm cell.<br /> European patent application, EP1710320A1: 1–30.<br /> thuật hỗ trợ sinh sản trong nước như IUI, ICSI 10. Gutiérrez R, Bécquer P, Pandolfi. A, Cuevillas G, Pupo J,<br /> hay trữ lạnh, cũng như tìm ra mối tương quan Hernández EW, Riverón G, Pereira N, Cuétara E (2007)<br /> giữa phân mảnh với tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi DNA damage measurement using a modified protocol of<br /> sperm chromatin dispersion test. Pharmacologyonline, 1: 14-<br /> tốt, tỷ lệ sinh sống … góp phần nâng cao tỷ lệ 19.<br /> thành công của các chu trình hỗ trợ sinh sản 11. Kazim RC, Jeanine TG, Marie L, Christopher JDJ, Douglas<br /> TC (2006) Comparison of Chromatin Assays for DNA<br /> cho bệnh nhân vô sinh hiếm muộn.<br /> Fragmentation Evaluation in Human Sperm. Journal of<br /> Lời cảm ơn: Chân thành cám ơn ThS. BS. Hồ Mạnh Tường đã Andrology, 27: 1, 53 – 59.<br /> tạo điều kiện cũng như tìm nguồn tài trợ kinh phí cho việc thực 12. Li-hong Z,Yi Q,Ke-hua W,Qiuju W, Guozhen T, Lei-guang<br /> hiện nghiên cứu. Cảm ơn các anh chị em trong Trung tâm W (2010) Measurement of sperm DNA fragmentation using<br /> Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản đã hỗ trợ về thời bright-field microscopy: comparison between sperm<br /> chromatin dispersion test and terminal uridine nickend<br /> gian, thiết bị để nghiên cứu được hoàn thành. Cám ơn các anh<br /> labeling assay. Fertility and Sterility, 94: 3, 1027 – 1032.<br /> chị kỹ thuật viên hỗ trợ sinh sản ở các bệnh viện Vạn Hạnh, Mỹ<br /> 13. Manicardi GC, Bianchi PG, Pantano S, Azzoni P, Bizzaro D,<br /> Đức, An Sinh đã đóng góp các ý kiến chuyên môn trong lĩnh Bianchi U (1995) Presence of endogenous nicks in DNA of<br /> vực hỗ trợ sinh sản. Cảm ơn các bạn tình nguyện viên đã sẵn ejaculated human spermatozoa and its relationship to<br /> sàng tham gia cung cấp nguồn mẫu cho nghiên cứu. Và cuối chromomycin A3 accessibility. Biol Reprod, 52: 864 - 7.<br /> cùng cảm ơn chị Mai, chị An, bé Trang đã bỏ nhiều thời gian, 14. Ribas – Maynou, Garcia, Abad (2012) Alkaline and neutral<br /> công sức cùng tôi thực hiện nghiên cứu này. comet assay profiles of sperm DNA damage in clinical<br /> groups. Hum Reprod, 27(3): 652 - 8.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 15. Schoor RA (2002) Prostatitis and male infertility: evidence<br /> and links. Curr Urol Rep, 3(4): 324 - 329.<br /> 1. Agarwal A, Saleh RA (2002) Role of oxidants in male<br /> 16. Tomlinson MJ, White A, Barratt CLR, Bolton AE, Cooke ID<br /> infertility: rationale, significance, and treatment. Urol Clin<br /> (1992) The removal of morphologically abnormal sperm<br /> North Am, 29: 817-27.<br /> forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes.<br /> 2. Agarwal A, Tsarev I, Erenpresis J, Sharma R (2012) Sperm<br /> Hum Repord, 7(4): 517 - 522.<br /> chromatin assessment. Textbook of Assisted Reproductive<br /> 17. Zini A, Kamal K, Phang D, Willis J, Jarvi K (2001a) Biologic<br /> Techniques. Volume 1: Laboratory Perspectives, 4th edition,<br /> variability of sperm DNA denaturation in infertile men.<br /> 75-95.<br /> Urology, 58, 258 - 261.<br /> 3. Enciso M, Sarasa J, Agarwal A, Fernandez JL, Gosalvez J<br /> (2009) A two-tailed Comet assay for assessing DNA damage<br /> in spermatozoa. Reprod Biomed Online, 18: 609-16.<br /> 4. Erenpresis J, Spano M, Erenpreisa J, Bungum M, Giwercman<br /> Ngày nhận bài báo: 02/09/2016<br /> A (2006) Sperm chromatin structure and male fertility: Ngày phản biện nhận xét bài báo: 05/09/2016<br /> biological and clinical aspects. Asian J Androl, 8: 11-29.<br /> Ngày bài báo được đăng: 10/10/2016<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 87<br />