Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19<br /> Triệu Tiến Sang*; Đào Văn Đôn*; Trần Văn Khoa*<br /> Trương Ngọc Nam*; Lê Thị Hải Yến*; Nguyễn Hoàng Hiệp**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng thành công quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C19. Đối tượng và<br /> phương pháp: 10 mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân (BN) sau đặt stent động mạch vành qua<br /> da tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103. Sử dụng phương pháp giải trình tự gen dựa trên<br /> nguyên lý của Sanger. Kết quả: đã phát hiện các đa hình của gen CYP2C19. Kết luận: đã xây<br /> dựng thành công quy trình xác định đa hình gen CYP2C19.<br /> * Từ khóa: Gen CY2C19; Đặt stent động mạch vành; Giải trình tự gen.<br /> <br /> Construction of Protocol for Screening CYP2C19 Polymophism Gene<br /> Summary<br /> Objectives: To construct successfully protocol screening CYP2C19 polymorphism gene.<br /> Subjects and methods: 10 patients with venous blood transfusions were placed at Department<br /> of Cardiology, 103 Hospital using a sequencing method based on Sanger's principle. Results:<br /> CYP2C19 polymorphism was detected. Conclusion: CYP2C19 gene polymorphism has been<br /> successfully established.<br /> * Keywords: Gene CYP2C19; Coronary stent; Sequencing.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cytochrome - P450 - 2C19 (CYP2C19)<br /> là một enzym thuộc siêu họ cytochrom<br /> P450, tham gia vào quá trình chuyển hóa<br /> các chất ngoại lai, bao gồm các thuốc<br /> kháng tiểu cầu như clopidogrel, thuốc<br /> chống động kinh, mephenytoin, omeprazol,<br /> diazepam và một số loại thuốc an thần...<br /> Khả năng chuyển hóa của CYP2C19 có<br /> thể được phân loại như sau: chuyển hóa<br /> siêu nhanh, chuyển hóa bình thường,<br /> chuyển hóa trung gian, hoặc chuyển hóa<br /> <br /> kém. Điều này dẫn đến có sự khác nhau<br /> trong phản ứng chuyển hóa thuốc và đáp<br /> ứng giữa các cá thể.<br /> Clopidogrel là một tiền thuốc chưa có<br /> tác dụng, sau quá trình chuyển hóa bởi<br /> CYP2C19 ở gan, clopidogrel sẽ được<br /> chuyển hóa thành chất có tác dụng chống<br /> kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa cục máu<br /> đông và giảm hình thành huyết khối.<br /> Việc xác định được kiểu gen CYP2C19<br /> có vai trò rất quan trọng trong tiên lượng đáp<br /> ứng thuốc, đặc biệt những thuốc chịu sự<br /> chuyển hóa qua enzym này như clopidogrel.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 02/06/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/09/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/09/2017<br /> <br /> 45<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> Một số hướng dẫn điều trị về can thiệp<br /> tim mạch đã đề cập đến việc cần làm xét<br /> nghiệm gen CYP2C19 trước khi chỉ định<br /> dùng clopidogrel. Để làm được điều đó,<br /> mỗi phòng thí nghiệm cần tối ưu hóa quy<br /> trình, ổn định điều kiện thí nghiệm trước<br /> khi áp dụng quy trình một cách thường quy.<br /> Với mong muốn đưa ra quy trình xác<br /> định kiểu gen CYP2C19, góp phần nâng<br /> cao hiệu quả điều trị, giảm biến chứng và<br /> nâng cao chất lượng cuộc sống người<br /> bệnh, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này<br /> nhằm: Xây dựng quy trình xác định đa<br /> hình gen CYP2C19.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 10 mẫu máu tĩnh mạch của BN sau đặt<br /> stent động mạch vành qua da tại Khoa<br /> Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103.<br /> Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí<br /> nghiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền Y<br /> học, Học viện Quân y.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Áp dụng phương pháp giải trình tự<br /> dựa trên nguyên lý Sanger, tiến hành<br /> theo 7 bước:<br /> - Xử lý mẫu.<br /> - Tách chiết ADN tổng số.<br /> - Kiểm tra chất lượng ADN tổng số.<br /> - Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP:<br /> CYP2C19*2, CYP2C19*3.<br /> - Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR.<br /> - Tinh sạch, giải trình tự.<br /> - Phân tích, đánh giá kết quả.<br /> * Xử lý mẫu:<br /> Cách lấy mẫu: lấy 4 ml máu từ tĩnh<br /> mạch BN vào ống lấy mẫu EDTA sau đặt<br /> 46<br /> <br /> sten động mạch vành qua da, đảm bảo<br /> không nhiễm khuẩn, ký hiệu mẫu và bảo<br /> quản ở điều kiện -4OC.<br /> * Tách chiết ADN tổng số:<br /> Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood<br /> ADN mini kit để tách ADN tổng số.<br /> Nguyên lý của kít này dựa trên sự hấp<br /> thụ chọn lọc của axít nucleic vào màng<br /> silica-gel trong điều kiện nhất định với 4<br /> giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải<br /> phóng ADN; ADN liên kết với màng silicagel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel<br /> với Wash Buffer; thu ADN.<br /> * Kiểm tra chất lượng ADN tổng số:<br /> Nguyên lý: phương pháp điện di dựa<br /> trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức<br /> kéo của điện trường tác động vào phân<br /> tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền.<br /> Sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện<br /> và tạo điện trường đề. Bản gel giúp phân<br /> tách các phân tử và thuốc nhuộm khác<br /> nhau để phát hiện vị trí phân tử trên gel<br /> sau khi điện di. Tốc độ di chuyển của<br /> ADN trong điện trường phụ thuộc vào<br /> kích thước đoạn ADN, điện tích, mức độ<br /> xoắn và dạng phân tử. Như vậy, so sánh<br /> kích thước các mẫu ADN với thang chuẩn<br /> sẽ đánh giá được chất lượng ADN.<br /> * Khuếch đại đoạn gen chứa SNP<br /> quan tâm:<br /> Nguyên lý: sử dụng kỹ thuật PCR để<br /> khuếch đại ADN. Dùng enzym polymerase<br /> để tổng hợp ADN mới từ 1 ADN khuôn<br /> ban đầu. Thành phần chính của phản<br /> ứng gồm: ADN khuôn, mồi, dung dịch<br /> đệm, 4 loại deoxyrinucleotid triphosphate<br /> (dNTP), ADN polymerase. Với 3 giai đoạn<br /> chính: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn<br /> mồi và giai đoạn kéo dài.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> * Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR:<br /> Sử dụng phương pháp điện di, nguyên<br /> lý và cách tiến hành tương tự như điện di<br /> kiểm tra chất lượng ADN sau khi tách<br /> chiết. Điện di trên giá thể là agarose pha<br /> trong đệm TAE 1X.<br /> * Tinh sạch và giải trình tự ADN:<br /> Nguyên lý: phương pháp giải trình tự<br /> Sanger dựa vào hoạt động của enzym ADN<br /> <br /> polymerase và dideoxynucleotid (ddNTP)<br /> tham gia vào quá trình tổng hợp ADN. Khi<br /> ADN polymerase xúc tác kéo dài mạch<br /> ADN mới gặp nucleotid không có nhóm<br /> 3’OH (dideoxynucleotid), phản ứng tổng<br /> hợp dừng lại và tạo ra các đoạn ADN<br /> chênh lệch nhau 1 nucleotid. Điện di đoạn<br /> ADN giúp xác định được trình tự ADN [3].<br /> * Phân tích kết quả: dựa trên phần<br /> mềm BioEdit.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả tách chiết ADN.<br /> Bảng 1:<br /> Mẫu<br /> <br /> Nồng độ ADN (ng/µl)<br /> <br /> A260/A280<br /> <br /> 1<br /> <br /> 19,42<br /> <br /> 1,7<br /> <br /> 2<br /> <br /> 25,62<br /> <br /> 1,8<br /> <br /> 3<br /> <br /> 19,49<br /> <br /> 1,85<br /> <br /> 4<br /> <br /> 19,33<br /> <br /> 2,72<br /> <br /> 5<br /> <br /> 27,9<br /> <br /> 1,79<br /> <br /> 6<br /> <br /> 26,24<br /> <br /> 1,9<br /> <br /> 7<br /> <br /> 19,6<br /> <br /> 2,03<br /> <br /> 8<br /> <br /> 22,51<br /> <br /> 2,13<br /> <br /> 9<br /> <br /> 24,1<br /> <br /> 2,04<br /> <br /> 10<br /> <br /> 30,98<br /> <br /> 2,1<br /> <br /> Nồng độ ADN trung bình 26.874 ng/µl. Tỷ lệ A260/A280 trung bình 1.923 (trong<br /> khoảng 1,8 - 2), nhìn chung dịch chiết ADN sạch và đủ nồng độ cho các nghiên cứu<br /> tiếp theo.<br /> 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR.<br /> Chúng tôi đã thiết kế được 2 cặp mồi dùng để xác định đa hình gen CYP2C19*2 và<br /> CYP2C19*3, đã tối ưu được thời gian và nhiệt độ phản ứng của 2 cặp mồi.<br /> CYP*2-F: 5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’<br /> CYP*2-R: 5’-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3’<br /> CYP*3-F: 5’- AAATTGTTTCCAACATTTAGCT-3’<br /> CYP*3-R: 5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’<br /> Chu trình nhiệt phản ứng: 96oC - 1 phút, 25 chu kỳ [96oC - 10 giây, 50oC - 5 giây,<br /> 60 C - 4 phút], 4oC.<br /> o<br /> <br /> 47<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> Thành phần phản ứng: master mix (promega): 12,5 µl; primer F: 0,5 µl; primer R:<br /> 0,5 µl; nước deion: 6,5 µl; ADN 5 µl.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR.<br /> (a) Gen CYP2C19*2<br /> <br /> Gen CYP2C19*3<br /> <br /> (F-/F+: các đối chứng âm/dương; M: Marker; 01 - 06: thứ tự các mẫu)<br /> Các mẫu có chất lượng tốt cho băng điện di sáng, rõ, có 1 băng duy nhất tương<br /> ứng với băng 140 bp (*2), 240 bp (*3). Đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào,<br /> chứng tỏ kết quả PCR đáng tin cậy.<br /> 3. Kết quả giải trình tự gen CYP2C19.<br /> * Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2:<br /> <br /> Hình 2: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 3.<br /> Không xuất hiện tín hiệu A, chỉ có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy<br /> định chuyển hóa bình thường.<br /> <br /> Hình 3: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 1.<br /> Đồng thời xuất hiện tín hiệu A và G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*2 quy định chuyển<br /> hóa trung bình.<br /> 48<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> <br /> Hình 4: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 5.<br /> Không xuất hiện tín hiệu G, chỉ có tín hiệu A, gen đồng hợp với kiểu gen *2/*2 quy<br /> định chuyển hóa kém.<br /> * Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3:<br /> <br /> Hình 5: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3 của mẫu số 1.<br /> Không xuất hiện tín hiệu A, chỉ có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy<br /> định chuyển hóa bình thường.<br /> <br /> Hình 6: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3 của mẫu số 6.<br /> Đồng thời xuất hiện tín hiệu A và G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*3 quy định chuyển<br /> hóa trung bình.<br /> 49<br /> <br />