Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của phức hợp Nanochitosan/PLA mang Nifedipine trên động vật thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN<br /> CỦA PHỨC HỢP NANOCHITOSAN/PLA MANG NIFEDIPINE<br /> TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br /> Cấn Văn Mão*; Nguyễn Minh Núi**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của phức hợp nanochitosan/PLA mang<br /> nifedipine (viết tắt là tổ hợp nifedipin-PLA) trên động vật thực nghiệm. Đối tượng và phương<br /> pháp: cho chuột uống thuốc và đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên tỷ lệ chết, các chỉ số huyết<br /> học và sinh hóa chức năng gan, thận cũng như hình ảnh mô bệnh học về chức năng gan, thận.<br /> Kết quả: với độc tính bán cấp, liều LD50 được xác định có giá trị 700 mg/kg (613,94 ± 786,06).<br /> Với độc tính bán trường diễn, không khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số về thể trạng<br /> chung, chức năng tạo máu, chức năng gan thận cũng như hình ảnh mô bệnh học giữa nhóm<br /> không uống thuốc và nhóm uống tổ hợp nifedipine-PLA (p > 0,05). Kết luận: tổ hợp nifedipinePLA an toàn trên cơ thể sống. Đây là tiền đề để tiếp tục nghiên cứu sử dụng tổ hợp nifedipinePLA trong điều trị tăng huyết áp trên người.<br /> *<br /> <br /> Từ khóa: Nifedipine-PLA; Độc tính cấp, bán trường diễn; Động vật thực nghiệm.<br /> <br /> Study of Acute and Subchronic Toxicities of Nifedipine-Embedded<br /> Nanochitosan/PLA’s in Experimental Animals<br /> Summary<br /> Objectives: To assess acute and subchronic toxicities of a drug, named nifedipine-embeded<br /> nanochitosan/PLA in experimental animals. Subjects and methods: After animals were<br /> administrated the drug, we asssed effects of the drug to rates of animal deaths, gerenal<br /> conditions of animals, the complete blood count, liver and kidney functions as well as<br /> histological images of livers and kindeys in experimental aimals. Results: In study of the acute<br /> toxicity, LD was 700 mg/kg (613.94 ± 786.06). In study of the subchronic toxicity, there were no<br /> significant differences in gerenal conditions of animals, the complete blood count, liver and<br /> kidney functions as well as histological images of livers and kindeys between one saline treated<br /> group and two nifedipine-PLA treated groups (p > 0.05). Conclusion: Nifedipine-PLA is safe in<br /> experimental animals. This is basis for us to conduct further studies to apply nifedipine-PLA for<br /> treatment hypertensions in humans.<br /> * Key word: Nifedipine-PLA; Acute, subchronic toxicities; Experimental animals.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh tăng huyết áp (THA) đang có xu<br /> hướng tăng ở nước ta và là nguyên nhân<br /> của nhiều bệnh lý và biến chứng khác.<br /> <br /> Một nghiên cứu cho thấy, THA chiếm tới<br /> chiếm tới 59,3% các nguyên nhân gây ra<br /> tai biến mạch máu não [1]. Những biến<br /> chứng này làm tăng chi phí điều trị và<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Cấn Văn Mão (canvanmao2001@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 07/01/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/03/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 27/03/2017<br /> <br /> 39<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> gánh nặng kính tế cho gia đình và xã hội.<br /> Do đó, điều trị THA có ý nghĩa quan trọng<br /> trong việc hạn chế các biến chứng của nó<br /> gây ra. Thuốc điều trị hiệu quả là vấn đề<br /> đang được quan tâm của Ngành Y tế.<br /> Có nhiều thuốc điều trị THA với cơ chế<br /> tác động gây giảm huyết áp khác nhau.<br /> Trong đó, thuốc nifedipin (chẹn kênh<br /> canxi) là một thuốc hay được dùng trong<br /> lâm sàng. Ưu điểm của nifedipine là tác<br /> dụng nhanh, sau vài phút có thể có tác<br /> dụng hạ áp ngay, nên hay được sử dụng<br /> trong cấp cứu cơn THA kịch phát. Tuy<br /> nhiên, thời gian tác dụng của nifedipine<br /> chỉ khoảng 4 - 6 giờ, nên khi sử dụng<br /> nifedipine trong điều trị THA thường phải<br /> sử dụng nhiều lần trong ngày [2]. Điều<br /> này dễ dẫn đến hiện tượng tích lũy thuốc<br /> và gây ra nhiều tác dụng không mong<br /> muốn như BN bị tụt huyết áp quá mức<br /> (khi đó huyết áp rất khó kiểm soát, cấp<br /> cứu tụt huyết áp trong trường hợp này rất<br /> khó khăn).<br /> Để hạn chế tác dụng không mong<br /> muốn này, nhiều nghiên cứu đã gợi ý sử<br /> dụng các loại nanoparticle như là chất<br /> mang, giúp kiểm soát sự hấp thu và giải<br /> phóng nifedepine tốt hơn [6]. Dựa trên<br /> nguyên lý này, chúng tôi đã tổng hợp một<br /> loại nanoparticle có tên là chitosan/PLA<br /> và gắn chitosan/PLA với nifedipine. Để<br /> đảm bảo an toàn và làm cơ sở nghiên<br /> cứu sử dụng tổ hợp nifedipine-PLA trên<br /> người, cần đánh giá độc tính của phức<br /> hợp này đối với cơ thể sống. Xuất phát từ<br /> vấn đề này, chúng tôi nghiên cứu đề tài<br /> này nhằm mục đích: Đánh giá độc tính<br /> cấp và bán trường diễn của tổ hợp<br /> nifedipin-PLA trên động vật thực nghiệm.<br /> 40<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> Đánh giá độc tính cấp 48 chuột nhắt<br /> trắng (trọng lượng 18 - 22 g) và đánh giá<br /> độc tính bán trường diễn 30 chuột cống<br /> trắng (trọng lượng 150 - 200 g) chủng<br /> Swiss. Cả 2 giống, khoẻ mạnh do Ban<br /> Cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện<br /> Quân y cung cấp. Chuột nuôi trong phòng<br /> thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý học 5 - 7<br /> ngày trước khi nghiên cứu, trong suốt<br /> thời gian nghiên cứu cho ăn bằng thức ăn<br /> dành riêng cho chuột, uống nước tự do.<br /> Quy trình nghiên cứu tuân thủ nghiêm<br /> ngặt hướng dẫn chăm sóc và sử dụng<br /> động vật của Học viện Quân y.<br /> 2. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu.<br /> - Tổ hợp nifedipine-PLA dạng bột do<br /> Viện Kỹ thuật Nhiệt đới (Viện Khoa học<br /> Việt Nam) cung cấp, hòa tan trong nước<br /> muối sinh lý và cho uống qua đường<br /> miệng.<br /> - Dung dịch NaCl 0,9% do Euro-Med<br /> (Philippine) sản xuất.<br /> - Các hóa chất xét nghiệm và làm tiêu<br /> bản mô bệnh học.<br /> - Cân điện tử (Nhật Bản), độ chính xác<br /> 0,001 gam.<br /> - Cốc chia vạch, kim cho chuột uống<br /> thuốc đầu tù.<br /> - Máy sinh hóa bán tự động BTS 350<br /> (Hãng Biosystem, Tây Ban Nha).<br /> - Máy phân tích huyết học Swelab<br /> Alpha (Hãng Swelab, Thụy Điển).<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Độc tính cấp:<br /> 48 chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên<br /> thành 6 lô khác nhau, mỗi lô 8 con. Tổ<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> - Tình trạng chung, thể trọng của<br /> chuột.<br /> <br /> hợp nifedipine-PLA uống với liều tăng<br /> dần trong cùng một thể tích để xác định<br /> liều thấp nhất gây chết 100% chuột và<br /> liều cao nhất không gây chết chuột (gây<br /> chết 0% chuột). Theo dõi tình trạng chung<br /> của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có<br /> dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, co giật,<br /> kích động, bài tiết…) và số lượng chuột<br /> chết trong vòng 72 giờ sau uống thuốc.<br /> Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá<br /> tổn thương đại thể. Từ đó xây dựng đồ thị<br /> tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử.<br /> <br /> - Đánh giá chức phận tạo máu thông<br /> qua số lượng hồng cầu, hàm lượng<br /> hemoglobin, số lượng bạch cầu, công<br /> thức bạch cầu.<br /> - Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan<br /> thông qua định lượng hoạt độ enzym<br /> trong máu: ALT, AST.<br /> - Đánh giá chức năng thận thông qua<br /> định lượng nồng độ ure, creatinin huyết<br /> thanh.<br /> <br /> * Độc tính bán trường diễn:<br /> <br /> Các thông số theo dõi được kiểm tra<br /> vào trước lúc tiêm thuốc, sau 4 tuần tiêm<br /> thuốc.<br /> <br /> Chuột cống trắng chia làm 3 lô, mỗi<br /> lô 10 con:<br /> - Lô chứng (n = 10): uống nước muối<br /> sinh lý 1 ml/100 g/ngày.<br /> <br /> * Mô bệnh học:<br /> Sau 4 tuần tiêm thuốc, mổ chuột quan<br /> sát đại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra<br /> ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của<br /> 30% số chuột ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi<br /> thể c thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu<br /> bệnh, Bệnh viện Quân y 103.<br /> <br /> - Lô trị 1 (n = 10): uống dung dịch tổ<br /> hợp nifedipine-PLA liều 3 mg/kg.<br /> - Lô trị 2 (n = 10): uống dung dịch tổ<br /> hợp nifedipine-PLA liều 15 mg/kg (gấp 5<br /> lần lô 1).<br /> Chuột được uống nước muối hoặc<br /> thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày một<br /> lần vào buổi sáng.<br /> <br /> * Phương pháp phân tích số liệu:<br /> Các số liệu được xử lý thống kê theo<br /> thuật toán thống kê t-test student bằng<br /> phần mềm Microsoft Excel, phần mềm<br /> SPSS.<br /> <br /> * Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong<br /> quá trình nghiên cứu:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Độc tính cấp.<br /> Chuột nhắt trắng uống dung dịch chứa tổ hợp nifedipine-PLA từ liều thấp nhất đến<br /> liều cao nhất. Lô chuột uống đến liều 1.150 mg/kg thể trọng chuột bị chết 100%, liều<br /> 400 mg/kg thể trọng chuột bị chết 0% sau 72 giờ uống thuốc.<br /> Bảng 1: Độc tính cấp của nifedipine-PLA.<br /> Lô<br /> <br /> Liều dùng<br /> (mg/kg)<br /> <br /> Số chuột<br /> thử (ni)<br /> <br /> Số chuột<br /> chết (ri)<br /> <br /> Số chuột<br /> sống (si)<br /> <br /> Tích số risi<br /> <br /> zi = 2k - 1<br /> - 2i<br /> <br /> Tích số rizi<br /> <br /> 1<br /> <br /> 400<br /> <br /> 10<br /> <br /> 0<br /> <br /> 8<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 2<br /> <br /> 550<br /> <br /> 10<br /> <br /> 3<br /> <br /> 7<br /> <br /> 21<br /> <br /> 7<br /> <br /> 147<br /> <br /> 3<br /> <br /> 700<br /> <br /> 10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4<br /> <br /> 24<br /> <br /> 5<br /> <br /> 120<br /> <br /> 41<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> 4<br /> <br /> 850<br /> <br /> 10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 3<br /> <br /> 21<br /> <br /> 3<br /> <br /> 63<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1.000<br /> <br /> 10<br /> <br /> 9<br /> <br /> 1<br /> <br /> 9<br /> <br /> 1<br /> <br /> 9<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1.150<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> Tính LD50 theo phương pháp cải tiến của Livschitz P.Z (1986). Theo phương pháp<br /> này, chúng tôi xác định được: LD50 = 700 mg/kg (613,94 ± 786,06).<br /> Kết quả nghiên cứu trên tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy<br /> LD50 của nifedipine trên chuột nhắt từ 700 - 1.000 mg/kg [4]. Tuy nhiên, cũng có sự<br /> khác biệt với một số tài liệu khác cho thấy LD50 trên chuột nhắt chỉ khoảng 200 - 300<br /> mg/kg, khác biệt ở đây có thể do giống, chủng loại và động vật thực nghiệm [7]. Khác<br /> biệt về LD50 trên chuột nhắt uống nifedipine với chuột uống tổ hợp nifedipine có thể do<br /> ảnh hưởng của nanochitosan/PLA khi sử dụng.<br /> 2. Độc tính bán trường diễn.<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đối với thể trạng chung của động vật:<br /> Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, ăn uống tốt,<br /> nhanh nhẹn, lông mượt, mắt sáng, phân khô.<br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của nifedipine-PLA đến thể trọng chuột.<br /> Lô chứng<br /> Thời gian<br /> <br /> Trọng<br /> lượng (g)<br /> <br /> Trước thí<br /> nghiệm<br /> <br /> 180,26 ±<br /> 7,83<br /> <br /> Sau 2 tuần<br /> thí nghiệm<br /> <br /> 195,13 ±<br /> 8,02<br /> <br /> p trước - sau<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau 4 tuần<br /> thí nghiệm<br /> <br /> 208,49 ±<br /> 7,85<br /> <br /> p trước - sau<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> Lô trị 1<br /> <br /> % tăng trọng Trọng lượng<br /> lượng<br /> (g)<br /> <br /> Lô trị 2<br /> <br /> % tăng trọng<br /> lượng<br /> <br /> Trọng lượng<br /> (g)<br /> <br /> 177,68 ±<br /> 9,81<br /> ↑8,25<br /> <br /> 190,40 ±<br /> 8,52<br /> <br /> 182,65 ±<br /> 10,86<br /> ↑7,15<br /> <br /> 195,59 ±<br /> 11,09<br /> <br /> > 0,05<br /> ↑15,66<br /> <br /> 202,97 ±<br /> 9,96<br /> <br /> % tăng trọng<br /> lượng<br /> <br /> ↑ 7,08<br /> <br /> > 0,05<br /> ↑14,23<br /> <br /> 206,63 ±<br /> 9,11<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> ↑13,13<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> Sau 4 tuần thí nghiệm, trọng lượng chuột ở các lô đều tăng so với trước khi nghiên<br /> cứu có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Trọng lượng chuột ở các lô uống dung dịch chứa<br /> tổ hợp nifedipine-PLA tăng ít hơn so với lô chứng sinh học, tuy nhiên sự khác biệt<br /> chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng tạo máu:<br /> Bảng 3: Thay đổi chức năng tạo máu trước và sau uống thuốc.<br /> Chỉ số<br /> Số lượng hồng cầu<br /> (T/L)<br /> <br /> 42<br /> <br /> Ngày thứ<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> p<br /> <br /> Lô chứng<br /> <br /> Lô trị 1<br /> <br /> Lô trị 2<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 6,03 ± 0,22<br /> <br /> 5,74 ± 0,35<br /> <br /> 5,93 ± 0,25<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 5,95 ± 0,40<br /> <br /> 5,80 ± 0,31<br /> <br /> 5,49 ± 0,33<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> Hàm lượng huyết sắc tố<br /> (g/dl )<br /> Số lượng bạch cầu (G/l)<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 12,72 ± 0,55<br /> <br /> 11,90 ± 0,63<br /> <br /> 12,40 ± 0,61<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 12,51 ± 0,67<br /> <br /> 11,84 ± 0,96<br /> <br /> 11,61 ± 0,84<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 5,14 ± 0,81<br /> <br /> 4,68 ± 0,63<br /> <br /> 4,98 ± 1,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 5,09 ± 0,78<br /> <br /> 4,58 ± 0,60<br /> <br /> 4,76 ± 0,70<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> ptrước-sau<br /> <br /> Sau 4 tuần thí nghiệm, các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu (số lượng hồng<br /> cầu, hàm lượng huyết sắc tố, số lượng bạch cầu ở cả lô trị 1 (uống nifedipine-PLA liều<br /> 3 mg/kg/ngày) và lô trị 2 (uống tổ hợp nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày) khác biệt<br /> không có ý nghĩa so với lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi uống<br /> thuốc thử (p > 0,05). Điều này chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA liều từ 3 - 15 mg/kg<br /> không làm ảnh hưởng đến chức năng tạo máu [2, 3, 4].<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng gan, thận:<br /> Bảng 4: Thay đổi chỉ số đánh giá chức năng gan thận.<br /> Chỉ số<br /> Hoạt độ AST<br /> (UI/L)<br /> Hoạt độ ALT<br /> (UI/L)<br /> Ure (mg/dl)<br /> Creatinin<br /> (mg/dl)<br /> p trước-sau<br /> <br /> Ngày thứ<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> p<br /> <br /> Lô chứng<br /> <br /> Lô trị 1<br /> <br /> Lô trị 2<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 101,20 ± 21,10<br /> <br /> 122,00 ± 14,47<br /> <br /> 130,12 ± 14,38<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 93,81 ± 9,66<br /> <br /> 113,39 ± 17,80<br /> <br /> 121,10 ± 19,73<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 35,57 ± 10,13<br /> <br /> 38,57 ± 19,99<br /> <br /> 20,46 ± 8,65<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 36,69 ± 10,19<br /> <br /> 39,44 ± 20,05<br /> <br /> 21,13 ± 8,97<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 7,74 ± 0,87<br /> <br /> 8,64 ± 3,12<br /> <br /> 7,90 ± 3,69<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 7,41 ± 1,06<br /> <br /> 7,50 ± 1,51<br /> <br /> 7,11 ± 1,78<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Trước uống<br /> <br /> 55,17 ± 7,50<br /> <br /> 64,39 ± 3,86<br /> <br /> 67,40 ± 5,14<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Sau uống 4 tuần<br /> <br /> 61,54 ± 8,84<br /> <br /> 70,99 ± 9,92<br /> <br /> 65,20 ± 7,06<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> - Về chức năng gan: sau 4 tuần thí<br /> nghiệm, các xét nghiệm đánh giá mức độ<br /> hủy hoại tế bào gan (hoạt độ AST, ALT<br /> trong máu chuột) ở cả lô trị 1 (uống<br /> nifedipine-PLA liều 3 mg/kg/ngày) và lô trị<br /> 2 (uống nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày)<br /> đều không khác biệt có ý nghĩa so với lô<br /> chứng và so sánh giữa hai thời điểm<br /> trước và sau khi uống thuốc thử (p > 0,05).<br /> Điều này chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA<br /> liều 3 - 15 mg/kg trong thời gian 4 tuần<br /> không gây tổn thương tế bào gan và<br /> không ảnh hưởng đến chức năng tạo mật<br /> của gan trên chuột [3, 4, 9].<br /> <br /> - Về chức năng thận: sau 4 tuần thí<br /> nghiệm, ở cả lô trị 1 (uống nifedipine-PLA<br /> liều 3 mg/kg/ngày) và lô trị 2 (uống<br /> nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày), nồng<br /> độ ure và creatinin trong máu chuột<br /> không thay đổi khác biệt có ý nghĩa thống<br /> kê so với lô chứng. Tương tự, các chỉ số<br /> này cũng không khác biệt giữa các lô ở<br /> cả hai thời điểm trước và sau 4 tuần thí<br /> nghiệm (p > 0,05). Điều này chứng tỏ tổ<br /> hợp nifedipine-PLA liều 3 - 15 mg/kg<br /> trong 4 tuần không gây tổn thương thận<br /> cũng như ảnh hưởng lên chức năng thận<br /> trên chuột [10].<br /> 43<br /> <br />