Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của bài thuốc HA-02 trên động vật thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN<br /> CỦA BÀI THUỐC HA-02 TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br /> Bùi Thanh Hà*; Trần Quốc Bảo*; Hoàng Trung Vinh*<br /> Đoàn Chí Cường*; Nguyễn Văn Chinh**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu tính an toàn của thuốc HA-02 trên động vật thực nghiệm. Phương pháp<br /> nghiên cứu: xác định độc tính cấp của thuốc bằng phương pháp Litchfield - Wilcoxon và xác<br /> định độc tính bán trường diễn của thuốc trên chuột nhắt trắng dòng Swiss. Kết quả: chuột uống<br /> liều 75 g/kg cân nặng không xác định được LD50 của thuốc. Với liều 5 g/kg/ngày và 60 g/ngày<br /> uống liên tục trong 15 - 30 ngày, thuốc không gây các thay đổi có ý nghĩa thống kê về số lượng<br /> hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng hemoglobin, hoạt độ enzym SGOT, SGPT, hàm lượng ure và<br /> creatinin so với lô chứng, thuốc cũng không gây biến đổi về tổ chức học của tế bào gan, thận<br /> trên chuột nghiên cứu. Kết luận: thuốc HA-02 không gây độc tính cấp cho chuột nhắt trắng và<br /> không làm thay đổi chức năng tạo máu, chức năng gan, thận của chuột thí nghiệm.<br /> * Từ khoá: Y học Cổ truyền; Thuốc thảo mộc; Bệnh tăng huyết áp; Bµi thuèc HA-02.<br /> <br /> Studying the Acute Toxicity and Semi-Chronic Toxicity of Herbal<br /> Medicines HA-02 on Experimental Animals<br /> Summary<br /> Objective: The research examines the safety of HA-02 drug on experimental animals. Subjects<br /> and methods: The acute and semi-chronic toxicities of the HA-02 drug were evaluated on 120<br /> mice by the Litchfield - Wilcoxon’s method on hematopoietic function, liver function and kidney.<br /> Results: With doses of 75 g/kg bw, HA-02 drug LD50 was not identified. With the doses of 5 g/kg<br /> and 60 g/kg per day for 15 - 30 consecutive days drinking, HA-02 drug was not significantly<br /> changed in number of erythrocytes, leukocytes, hemoglobin concentration, activity of SGOT,<br /> SGPT, urea and creatinine levels. In addition, the HA-02 drug did not cause any change in<br /> histology of liver and kidney of experimental mice. Conclusion: The HA-02 drug is not toxic for<br /> mice and mice hematopoietic function, liver function and kidney function were not changed.<br /> * Key words: Traditional medicine; Herbal medicine; Hypertension; HA-02.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tăng huyết áp (THA) là bệnh nguy hiểm cã<br /> tỷ lệ tử vong cao và để lại những di chứng<br /> nặng nề như tai biến mạch máu não, nhồi<br /> <br /> máu cơ tim... ảnh hưởng đến cuộc sống của<br /> người bệnh và trở thành gánh nặng kinh tế<br /> cho gia đình người bệnh và xã hội.<br /> <br /> * Bệnh viện Quân y 103<br /> ** Bệnh viện Quân y 105<br /> Người phản hồi (Corresponding): Bùi Thanh Hà (buitha103@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 05/02/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 31/03/2015<br /> <br /> 50<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> Nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh<br /> và phát triển các loại thuốc có hiệu quả<br /> trong điều trị THA và các biến chứng của<br /> THA được nhiều nhà khoa học trong nước<br /> và trên thế giới quan tâm từ lâu và hiện<br /> vẫn là vấn đề vô cùng cấp thiết.<br /> Thực hiện phương châm kết hợp hai<br /> nền y học, Bộ môn - Khoa Y học Cổ truyền,<br /> Bệnh viện Quân y 103 trên cơ sở biện chứng<br /> luận trị theo lý luận của Y học Cổ truyền<br /> (YHCT) về nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh<br /> của bệnh THA, đồng thời vận dụng kết<br /> quả nghiên cứu theo y học hiện đại về tác<br /> dụng dược lý của từng vị thuốc đã xây<br /> dựng bài thuốc “HA-02” gồm 15 vị thuốc<br /> đông dược để điều trị bệnh THA. Bài thuốc<br /> có tác dụng bình can tiềm dương, tư bổ can<br /> thận âm, hoạt huyết, trừ đàm và lợi thủy.<br /> Để tìm hiểu một cách có khoa học và đầy<br /> đủ về tính an toàn của thuốc HA-02 làm cơ<br /> sở cho điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài<br /> này với mục tiêu: Xác định độc tính cấp và<br /> độc tính bán trường diễn của thuốc HA-02.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu, phƣơng tiện và đối<br /> tƣợng nghiên cứu.<br /> * Nguyên liệu nghiên cứu:<br /> - Công thức bài thuốc HA-02:<br /> Thạch quyết minh (Concha haliotidis)<br /> 20 g, Câu đằng (Ramulus cum uncariae uncis)<br /> 20 g, Thiên ma (Rhizoma gastrodiae) 15 g,<br /> Bạch thược (Radix paconiae alba) 15 g,<br /> Đương quy (Radix angelicae sinensis)<br /> 15 g, Xuyên khung (Rhizoma chuanxiong)<br /> 12 g, Ngưu tất (Radix achyranthis bidentatae)<br /> 12 g, Đại hoàng (Rhizoma rhei) 6 g, Trạch tả<br /> (Rhizoma alismatis) 12 g, Ích mẫu (Herba<br /> leonuri) 20 g, Bình vôi (Stephania glabra)<br /> 12 g, Đỗ trọng (Cortex eucommiae) 15 g,<br /> 51<br /> <br /> Chỉ xác (Fructus citri aurantii) 15 g, Tang ký<br /> sinh (Ramulus lorantoran parasiticus) 15 g,<br /> Đan sâm (Radix salviae militiorrhizae) 20 g.<br /> - Dạng thuốc sử dụng: cao đặc tỷ lệ 2/1.<br /> - Thuốc được bào chế tại Xí nghiệp<br /> Dược phẩm TW1 đạt Tiêu chuẩn Dược<br /> điển Việt Nam IV, do Khoa Dược - Bệnh<br /> viện Quân y 103 cung cấp.<br /> * Phương tiện và trang thiết bị dùng<br /> trong nghiên cứu:<br /> Máy xét nghiệm huyết học tự động<br /> Coulter LH 780, máy xét nghiệm sinh hóa<br /> tự động AU5800 (Hãng Beckman Coulter),<br /> kính hiển vi.<br /> * Đối tượng nghiên cứu:<br /> Chuột nhắt trắng dòng Swiss, trọng lượng<br /> 20 ± 5 g/con: 120 con do Ban Cung cÊp<br /> động vật thí nghiệm - Học viện Quân y cung<br /> cấp, được nuôi trong điều kiện phòng thí<br /> nghiệm của Khoa Sinh lý, Học viện Quân y,<br /> ăn theo tiêu chuẩn động vật nghiên cứu,<br /> uống nước (đun sôi để nguội) tự do.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Thử độc tính cấp:<br /> Thực hiện tại Khoa Sinh lý, Học viện<br /> Quân y theo phương pháp Litchfield Wilcoxon, quy định của WHO và Quy chế<br /> Đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc<br /> cổ truyền của Bộ Y tế. Tính liều LD50 theo<br /> phương pháp Behrens - Karber [1, 2, 4].<br /> Trước khi cho uống thuốc, chuột bị bỏ<br /> đói trong 18 giờ. Chia ngẫu nhiên chuột<br /> thành 6 lô, mỗi lô 10 con. Lô chứng uống<br /> nước cất, các lô thử uống thuốc với mức<br /> liều 15 g, 30 g, 45 g, 60 g, 75 g/kg thể<br /> trọng. Mỗi chuột uống 3 giờ/lần x 3 lần/24<br /> giờ. Nước cất và thuốc thử được đưa<br /> thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong<br /> đầu tù với cùng thể tích 0,2 ml/10 g thể<br /> trọng chuột/lần.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> Theo dõi tình trạng chung và số lượng<br /> chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Tìm liều<br /> cao nhất chuột không chết và liều thấp<br /> nhất gây chết 100%. Tiếp tục theo dõi<br /> tình trạng chung của chuột đến hết ngày<br /> thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu.<br /> * Thử độc tính bán trường diễn:<br /> Thực hiện tại Khoa Sinh lý, Học viện<br /> Quân y theo phương pháp Abraham, quy<br /> định của WHO và Quy chế Đánh giá tính<br /> an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền của<br /> Bộ Y tế [1, 3, 4].<br /> Chia 60 chuột làm 3 lô, mỗi lô 20 con:<br /> lô chứng: uống nước cất; lô thử 1: uống<br /> thuốc HA-02, liều 5 g/kg/ngày (tương đương<br /> với liều dùng trên người); lô thử 2: uống<br /> thuốc HA-02, liều 60 g/kg/ngày (gấp 12<br /> lần liều dùng trên người). Nước cất và<br /> thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày<br /> chuột bằng kim cong đầu tù vào các buổi<br /> sáng từ 8 - 10 giờ, 1 lần/ngày với cùng<br /> thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng, uống liên<br /> tục trong 30 ngày.<br /> <br /> Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong<br /> quá trình nghiên cứu: tình trạng chung,<br /> thể trạng chuột. Đánh giá chức năng tạo<br /> máu thông qua số lượng hồng cầu, bạch<br /> cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin.<br /> Đánh giá chức năng gan thông qua định<br /> lượng một số enzym: SGOT, SGPT.<br /> Đánh giá chức năng thận thông qua định<br /> lượng ure, creatinin trong huyết tương<br /> chuột bằng phương pháp quang động<br /> học đo hoạt tính enzym theo khuyến cáo<br /> của Hội Hóa sinh lâm sàng Quốc tế. Các<br /> thông số theo dõi được kiểm tra trước<br /> khi uống thuốc, sau 15 ngày và 30 ngày<br /> uống thuốc.<br /> - Mô bệnh học: sau 30 ngày uống<br /> thuốc, mổ chuột quan sát đại thể toàn bộ<br /> các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu<br /> trúc vi thể gan thận của 50% chuột ở mỗi<br /> lô. Các xét nghiệm vi thể được thực hiện<br /> tại Bộ môn - Khoa Giải phẫu bệnh và<br /> Pháp y, Bệnh viện Quân y 103.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Thử độc tính cấp (LD50) của thuốc HA-02.<br /> Bảng 1: Độc tính cấp của thuốc HA-02.<br /> LÔ<br /> <br /> SỐ CHUỘT<br /> THÍ NGHIỆM<br /> <br /> LIỀU DÙNG (g/kg)<br /> <br /> THỂ TÍCH<br /> CHO UỐNG<br /> <br /> SỐ CHUỘT SỐNG/CHẾT SAU<br /> 72 GIỜ<br /> <br /> 1<br /> <br /> 10<br /> <br /> Nước cất<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 10<br /> <br /> 15<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> 3<br /> <br /> 10<br /> <br /> 30<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 10<br /> <br /> 45<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 60<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> 6<br /> <br /> 10<br /> <br /> 75<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> Sau 72 giờ uống thuốc, ở lô chứng và lô thử với liều tõ 15 - 45 g/kg cân nặng, chuột<br /> hoạt động và ăn uống bình thường, không bị khó thở, đi ngoài phân khô. Ở liều cao<br /> 60 - 75 g/kg cân nặng, hoạt động của chuột giảm, nhưng không có hiện tượng bỏ ăn<br /> 52<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> hoặc khó thở. Không có chuột nào chết trong thời gian theo dõi, do đó chưa xác định<br /> được LD50 của thuốc.<br /> 2. Thử độc tính bán trƣờng diễn của thuốc HA-02.<br /> * Tình trạng chuột:<br /> Trong 30 ngày thí nghiệm, chuột ở các nhóm đều hoạt động bình thường, nhanh nhẹn,<br /> ăn uống tốt, phân khô, lông mượt, không có chuột bị chết hoặc có biểu hiện bất thường.<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đến phát triển trọng lượng chuột:<br /> Bảng 2: Trọng lượng chuột trước và sau uống thuốc.<br /> CÂN NẶNG (g)<br /> <br /> p<br /> <br /> THỜI GIAN<br /> <br /> Chứng (1) (n = 20)<br /> <br /> Thử 1 (2) (n = 20)<br /> <br /> Thử 2 (3) (n = 20)<br /> <br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 22,3 ± 1,67<br /> <br /> 21,5 ± 1,4<br /> <br /> 21,2 ± 1,2<br /> <br /> Sau 15 ngày (b)<br /> <br /> 24,9 ± 1,1<br /> <br /> 24,1 ± 0,97<br /> <br /> 22,3 ± 1,1<br /> <br /> Sau 30 ngày (c)<br /> <br /> 24,9 ± 1,1<br /> <br /> 24,1 ± 0,97<br /> <br /> 23,9 ± 1,06<br /> <br /> p<br /> <br /> p1-2 > 0,05<br /> p1-3 > 0,05<br /> p2-3 > 0,05<br /> <br /> pa-b > 0,05; pa-c > 0,05; pb-c > 0,05<br /> <br /> So sánh trọng lượng cơ thể chuột ở 2 lô dùng thuốc HA-02 với lô đối chứng sinh<br /> học tại các thời điểm thấy thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). So sánh giữa<br /> các thời điểm sau so với trước thấy trọng lượng cơ thể chuột ở 3 lô đều tăng, sự thay<br /> đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Chứng tỏ thuốc HA-02 ở cả 2 mức liều<br /> không ảnh hưởng đến phát triển cân nặng bình thường của chuột.<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng tạo máu chuột:<br /> Bảng 3: Chỉ số huyết học của chuột sau thí nghiệm.<br /> KẾT QUẢ (n = 10)<br /> CHỈ SỐ<br /> <br /> Hồng cầu (T/l)<br /> <br /> NGÀY THỨ<br /> <br /> Chứng (1)<br /> <br /> Thử 1 (2)<br /> <br /> Thử 2 (3)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 7,1 ± 1,3<br /> <br /> 6 ± 1,7<br /> <br /> 6,56 ± 1,48<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 6,9 ± 2,4<br /> <br /> 5,6 ± 1,5<br /> <br /> 6,44 ± 1,65<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> Bạch cầu (G/l)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 6,9 ± 1,3<br /> <br /> 7,4 ± 1,89<br /> <br /> 7,1 ± 1,5<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 7,9 ± 0,4<br /> <br /> 8,1 ± 0,5<br /> <br /> 7,1 ± 1,23<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> Hemoglobin (g/l)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 11,6 ± 1,0<br /> <br /> 11,4 ± 1,34<br /> <br /> 10,7 ± 1,14<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 12,3 ± 0,5<br /> <br /> 12,5 ± 0,8<br /> <br /> 10,9 ± 1,13<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> 53<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> Tiểu cầu<br /> (G/l)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 819 ± 133<br /> <br /> 714 ± 200<br /> <br /> 715 ± 234<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 822 ± 205<br /> <br /> 884 ± 241<br /> <br /> 694 ± 224<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> So sánh trong từng lô giữa các thời điểm và giữa các lô ở cùng một thời điểm thấy,<br /> số lượng hồng cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin thay đổi không có ý nghĩa thống<br /> kê (p > 0,05) giữa nhóm chứng và nhóm nghiên cứu.<br /> Như vậy, thuốc HA-02 cho chuột uống liên tục trong thời gian 15 ngày và 30 ngày ở<br /> cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới số lượng hồng cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin.<br /> Chứng tỏ thuốc an toàn với chức năng tạo máu khi dùng kéo dài.<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng gan, thận chuột:<br /> Bảng 4: Các chỉ số sinh hóa máu của chuột sau thí nghiệm.<br /> KẾT QUẢ (n = 10)<br /> CHỈ SỐ<br /> <br /> Ure (mmol/l)<br /> <br /> NGÀY THỨ<br /> <br /> Chứng (1)<br /> <br /> Thử 1 (2)<br /> <br /> Thử 2 (3)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 6,1 ± 1,1<br /> <br /> 6,1 ± 1,44<br /> <br /> 4,9 ± 1,11<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 6 ± 2,3<br /> <br /> 6,8 ± 1,3<br /> <br /> 5,43 ± 1,05<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> Creatinin (mmol/l)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 32,7 ± 13,0<br /> <br /> 27,6 ± 6,63<br /> <br /> 32 ± 7,4<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 38 ± 29,3<br /> <br /> 27,8 ± 4,2<br /> <br /> 30 ± 7,66<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> SGOT (u/l)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 27,3 ± 5,65<br /> <br /> 25,2 ± 7,04<br /> <br /> 28,8 ± 7,2<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 26,37<br /> <br /> 24,4 ± 7,7<br /> <br /> 28,7 ± 6,62<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> SGPT (u/l)<br /> <br /> N15 (a)<br /> <br /> 4,9 ± 1,7<br /> <br /> 4,88 ± 1,35<br /> <br /> 4,4 ± 1,3<br /> <br /> N30 (b)<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4,8 ± 1,4<br /> <br /> pa-b > 0,05<br /> <br /> So sánh trong từng lô giữa các thời điểm và giữa các lô ở cùng một thời điểm thấy,<br /> nồng độ ure, creatinin, SGOT, SGPT thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> Như vậy, thuốc HA-02 cho chuột uống liên tục trong thời gian 15 ngày và 30 ngày ở<br /> cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới nồng độ ure, creatinin, SGOT, SGPT trong máu<br /> chuột. Chứng tỏ thuốc an toàn đối với chức năng gan, thận khi dùng kéo dài.<br /> * Ảnh hưởng của thuốc đến mô bệnh học gan, thận chuột:<br /> - Quan sát đại thể: sau khi mổ chuột, quan sát thấy các tổ chức gan, thận, tim, phổi,<br /> hệ thống tiêu hóa của chuột ở lô chứng và 2 lô dùng thuốc đều bình thường, không có<br /> biểu hiện xung huyết hay dấu hiệu bị tổn thương.<br /> 54<br /> <br />