Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (--SEA) gây bệnh Αlpha Thalassemia bằng kỹ thuật PCR

Chia sẻ: ViThimphu2711 ViThimphu2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc chẩn đoán xác định người mang đột biến dị hợp tử - SEA có ý nghĩa lớn với việc chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai bị Hb Bart’s có vai trò quan trọng cho tư vấn di truyền.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (--SEA) gây bệnh Αlpha Thalassemia bằng kỹ thuật PCR

NGHIÊN CỨU PHỤ SẢN/DI TRUYỀN Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (--SEA) gây bệnh Αlpha Thalassemia bằng kỹ thuật PCR Đào Thị Trang1, Hoàng Thị Ngọc Lan1,2, Nguyễn Thị Hảo1, Bùi Thị Lành1, Hoàng Thị Hải1, Đoàn Thị Kim Phượng1,3 1 Trường Đại học Y Hà Nội 2 Bệnh viện Phụ sản Trung ương 3 Bệnh viện Đại học Y Hà Nội doi:10.46755/vjog.2020.1.790 Tác giả liên hệ (Corresponding author): Đào Thị Trang, email: daotrang.dt39@gmail.com Nhận bài (received) 05/12/2019 - Chấp nhận đăng (accepted) 20/04/2020 Tóm tắt Đặt vấn đề: Chẩn đoán xác định người mang đột biến dị hợp tử --SEA có ý nghĩa lớn với việc chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai bị Hb Bart’s có vai trò quan trọng cho tư vấn di truyền. Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của việc phát hiện đột biến --SEA bằng phương pháp PCR. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 66 mẫu DNA tách chiết từ 31 mẫu máu và 35 mẫu ối tươi/ối nuôi cấy đã làm xét nghiệm đột biến gen α globin bằng phương pháp lai phân tử ngược tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Các mẫu DNA được PCR bằng mồi đã thiết kế, sau đó điện di để xác định đột biến --SEA. So sánh kết quả giữa hai phương pháp. Kết quả: Đoạn mồi thiết kế đã khuếch đại thành công đoạn gen mang đột biến --SEA. 66/66 mẫu máu và mẫu ối có kết quả 100% tương đồng giữa hai phương pháp. Kết luận: PCR là một phương pháp chính xác, đơn giản, nhanh chóng và kinh tế trong chẩn đoán người mang gen cũng như chẩn đoán thai thi mang đột biến --SEA. Từ khóa: α-thalassemia, đột biến --SEA, PCR, kỹ thuật lai phân tử ngược. Detection of the (--SEA) double αlpha-globin gene deletion by simple PCR method Dao Thi Trang1, Hoang Thi Ngoc Lan1,2, Nguyen Thi Hao1, Bui Thi Lanh1, Hoang Thi Hai1, Doan Thi Kim Phuong1,3 1 Ha Noi Medical University 2 National Hospital of Obstetrics and Gynecology 3 Hanoi Medical University Hospital Abstract Background: Detecting the carriers of SEA double deletion, as well as fetuses with Hb Bart’s syndrome is essential to prenatal diagnosis. Objectives: Evaluating accuracy and the cost-effectiveness of a simple PCR method in determining --SEA mutation. Materials and methods: 66 DNA extraction products of 31 blood and 35 amniotic fluid samples were tested for --SEA mutation by hybridization technique in Genetic Counseling Centre, Hanoi Medical University Hospital. These samples were diagnosed --SEA mutation by the combined gap-PCR method (with the designed primers) and agarose gel electro- phoresis. The results of this PCR assay were compared with that of the reserved hybridization method. Results: These designed primers have made successful PCR to detect --SEA deletion. The results of the PCR assay were completely in concordance with that of the reserved hybridization method. Conclusion: Application of PCR assay on detecting --SEA double alpha globin gene deletion is exact, simple, rapid (to- wards both blood and prenatal samples) and cost-effective in Vietnam. Keywords: α-thalassemia, --SEA mutation, PCR method, reserved hybridization technique. Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 27
1. ĐẶT VẤN ĐỀ Αlpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm các đoạn mồi tự thiết kế, nhằm rút ngắn thời gian cũng sắc thể thường do đột biến gen α-globin, gây thiếu máu như đơn giản hóa kỹ thuật xét nghiệm và tăng hiệu quả tan máu mạn tính hoặc phù thai, thai chết lưu [1]. Xác về mặt chi phí. Đánh giá tính chính xác của xét nghiệm định người mang đột biến --SEA có vai trò quan trọng PCR trong việc phát hiện người bệnh và thai nhi có đột trong tư vấn chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai biến --SEA bằng việc so sánh kết quả với phương pháp nhi mắc hội chứng Hb Bart’s có ý nghĩa đối với việc tiên lai phân tử. lượng cho thai nhi, hạn chế những biến chứng nguy hiểm cho thai phụ và cung cấp thông tin di truyền hữu ích cho 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU gia đình. Hiện nay, tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, các Đối tượng nghiên cứu: 66 mẫu DNA được tách chiết phương pháp phát hiện đột biến --SEA chủ yếu dựa vào từ 31 mẫu máu ngoại vi và 35 mẫu tế bào ối tươi/ối nuôi kit thương mại với nguyên lý lai phân tử ngược. Phương cấy của người hoặc thai nhi có chỉ định xét nghiệm đột pháp này có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng lúc biến gen α-thalassemia tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội từ nhưng kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian và giá thành cao. tháng 4/2019 đến 10/2019. Nghiên cứu có sử dụng DNA Trong khi đó, nhiều nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy của người bình thường và mẫu tế bào ối của thai không đột biến mất đoạn lớn dạng SEA ở người có nguy cơ cao có nguy cơ mang đột biến --SEA để làm mẫu đối chứng. mang gen α-thalassemia lên đến 87,35 - 95% [2,3]. Do đó, Phương pháp nghiên cứu: Mỗi mẫu DNA (tách chiết trong nhiều trường hợp chỉ cần xác định đột biến SEA là bằng kít của hãng Qiagen, Đức) được xác định đột biến đủ ý nghĩa lâm sàng. Trên thế giới cũng như trong nước gen bằng 2 phương pháp: lai phân tử ngược và PCR đột đã có nhiều bệnh viện, trung tâm sử dụng phương pháp biến --SEA. So sánh kết quả phát hiện đột biến của 2 PCR để phát hiện đột biến --SEA. Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp. tác giả sử dụng các cặp mồi giống nhau để khuếch đại Thiết kế mồi: đoạn gen α globin bình thường và đột biến --SEA với kích Các cặp mồi cho phản ứng PCR được thiết kế để khu- thước sản phẩm khá lớn, lần lượt là 1800 bp và 1349 bp, ếch đại đoạn gen α-globin bình thường và trình tự gen liền dẫn tới khó thực hiện và kéo dài phản ứng khuếch đại [4]. kề với đột biến --SEA. Sử dụng chương trình Primer-BLAST Từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) để nghiên cứu nhằm mục tiêu: Phát triển kỹ thuật PCR với thiết kế mồi. Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Trình tự mồi, nồng độ mồi và kích thước sản phẩm sau PCR Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Kích thước sản phẩm (bp) α/SEA(F) CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC 1019 α(R) TGAAGAGCCTGCAGGACCAGGTCAGT α/SEA(F) CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC 669 SEA(R) ATATATGGGTCTGGAAGTGTATCCCTC Phản ứng PCR: 720C x 23s; 720C x 60s. Tổng thời gian PCR khoảng 31 Mỗi phản ứng 20 µl bao gồm: 8 µl PCR Master mix 2X phút. Sau khi PCR, điện di sản phẩm trên thạch agarose (0,8 U/µl, ThermoFisher Scientific), 0,5 µl mỗi loại primer, 1,5%, trong 35 phút. 10 - 100 ng DNA (thể tích cho vào tùy thuộc nồng độ Kỹ thuật lai phân tử ngược: mẫu, không quá 20% thể tích phản ứng PCR), DMSO 0,5% Sử dụng bộ kít Thalassemia Gene Diagnostic (Hy- 0,5 µl, Betaine 0,5M 2,5 µl, nước cất vừa đủ 20 µl. Chu bribio)/Thalassemia α-Globin StripAssay (ViennaLab) trình nhiệt: 980C x 10s; 30 chu kỳ: 980C x 1s; 660C x 5s; đã có chứng chỉ CE/IVD. 28 Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A B Hình 1. Hình ảnh điện di phát hiện đột biến --SEA bằng kỹ thuật PCR và hình ảnh kết quả lai phân tử Hình 1.A. Điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi thiết kế. Chú thích: L: Thang chuẩn; 1: mẫu chứng không đột biến --SEA, 2: mẫu chứng đồng hợp tử đột biến -- SEA, 3: mẫu chứng dị hợp tử đột biến --SEA (mẫu máu), 4 (mẫu tế bào ối tươi): đồng hợp tử đột biến --SEA; 5 (mẫu tế bào ối tươi): dị hợp tử --SEA; 6 (mẫu tế bào ối tươi): không đột biến --SEA. Hình 1.B. Hình ảnh kết quả lai tương ứng kết quả PCR 1 --> 6; Màng lai 1: Không phát hiện đột --SEA và các đột biến gen thalassemia khác được khảo sát. Màng lai 2: Đồng hợp tử đột biến --SEA. Màng lai 3: Dị hợp tử đột biến -- SEA. Thanh lai 4: Đồng hợp tử đột biến --SEA. Thanh lai 5: Dị hợp tử đột biến --SEA. Thanh lai 6: Không phát hiện đột --SEA và các đột biến gen α-thalassemia khác được khảo sát. Bảng 2. So sánh kết quả phát hiện đột biến --SEA trên mẫu máu, mẫu ối tươi và mẫu ối nuôi cấy Loại mẫu Mẫu máu Mẫu ối tươi/ối nuôi cấy Tỷ lệ phù hợp Phương pháp Lai phân tử PCR Lai phân tử PCR kết quả Kết quả n (%) n (%) n (%) n (%) Không đột biến 13 (41,9%) 13 (41,9%) 15 (42,9%) 15 (42,9%) 100% Dị hợp tử 17 (54,8%) 17 (54,8%) 14 (40%) 14 (40%) 100% 1 (3,2%) Đồng hợp tử 1 (3,2%) 6 (17,1%) 6 (17,1%) 100% (máu cuống rốn) Trong 31 mẫu máu và 35 mẫu ối, tỷ lệ phát hiện đột biến --SEA cho kết quả hoàn toàn trùng khớp với phương pháp lai phân tử ngược. Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 29
Bảng 3. So sánh kết quả phát hiện đột biến --SEA trên 16 mẫu ối tươi Phương pháp Lai phân tử PCR PCR Tỷ lệ phù hợp (ối nuôi cấy) (ối tươi) (ối nuôi cấy) kết quả Kết quả n (%) n (%) n (%) Không đột biến 6 (37,5%) 6 (37,5%) 6 (37,5%) 100% Dị hợp tử 6 (37,5%) 6 (37,5%) 6 (37,5%) 100% Đồng hợp tử 4 (25%) 4 (25%) 4 (25%) 100% Trong 35 mẫu ối của nghiên cứu, có 16 mẫu được thực hiện kỹ thuật PCR phát hiện đột biến --SEA trên cả hai loại mẫu (của cùng một bệnh nhân) là tế bào ối tươi và tế bào ối qua nuôi cấy. Kết quả phát hiện đột biến --SEA bằng PCR trên 16 mẫu ối tươi, cho kết quả phù hợp với ối nuôi cấy bằng cả hai phương pháp, lai phân tử ngược và PCR. Bảng 4. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp PCR với đột biến --SEA PCR Có đột biến (n,%) Không đột biến (n,%) Tổng số Lai Có đột biến 38 (57,6) 0 (0%) 38 Không đột biến 0 (0,0) 28 (42,4%) 28 Tổng số 38 (57,6) 28 (42,4%) 66 Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR trong xét nghiệm xác định đột biến --SEA là 100% khi so với phương lai phân tử ngược. 4. BÀN LUẬN tử --SEA ở người có sàng lọc mang gen α-thalassemia Mồi thiết kế đã khuếch đại được đoạn gen mang đột lên đến 95% khi sử dụng phương pháp lai phân tử ngược. biến --SEA cũng như đoạn gen α-globin bình thường. Các 91,5% trường hợp đột biến dị hợp tử --SEA nằm trong cặp mồi được thiết kế lại giúp giảm nhiệt độ nóng chảy nhóm công thức máu có MCV và MCH giảm nhiều (MCV của mồi (Tm), tăng khả năng gắn mồi chính xác; cùng ≤ 75 fl và MCH ≤ 24 pg) [5]. Như vậy, với những trường với việc sử dụng master mix phù hợp, thời gian khuếch hợp bệnh nhân có MCV, MCH giảm nhiều và HbA2 < 3,5% đại chuỗi khi so với các phương pháp PCR, gap-PCR (không có Hb bất thường khác), việc thực hiện phương hoặc multiplex PCR trước đây, đã giảm từ hơn 2,5 giờ pháp PCR cho thấy hiệu quả về mặt chi phí, kỹ thuật và [6,7] xuống chỉ còn khoảng 30 phút. Phương pháp PCR thời gian xét nghiệm (so sánh chi tiết được nêu trong trong nghiên cứu này cho thấy tính chính xác với độ nhạy Bảng 5). Trong các trường hợp phương pháp PCR không và độ đặc hiệu là 100% khi so với kỹ thuật lai phân tử phát hiện đột biến --SEA hoặc nghi ngờ dị hợp tử kép, có ngược (đã có chứng nhận CE/IVD). Theo nghiên cứu tại thể thực hiện các phương pháp chẩn đoán phát hiện đa Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản đột biến sau đó. Trung ương năm 2018 cho thấy tỷ lệ gặp đột biến dị hợp Bảng 5. So sánh phương pháp lai và phương pháp PCR Phương pháp Phương pháp lai Phương pháp PCR Tiêu chí Trên thanh Trên màng Thời gian 7 - 8 giờ 4,5 - 5 giờ 70 phút Chi phí 5.000.000 đồng 3.500.000 đồng Khoảng 500.000 đồng 21 đột biến 5 đột biến α Số đột biến phát hiện 1 đột biến --SEA α-thalassemia 16 đột biến β Nồng độ DNA yêu cầu 2 - 20 ng/µl ~ > 50 ng/µl ≥ 2,5 ng/µl Máu, tế bào ối nuôi Máu, tế bào ối nuôi cấy, tế Mẫu thực hiện được Máu, tế bào ối nuôi cấy cấy bào ối tươi Trang thiết bị yêu cầu Máy PCR, buồng điện di, Máy PCR, bể ổn nhiệt, Máy PCR, buồng điện di bể ổn nhiệt, máy ủ lắc máy lai của hãng Hybribio 30 Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790
Trong các trường hợp chẩn đoán trước sinh, kỹ thuật 7. Jomoui, W., et al. Genetic origin of α(0)-thalassemia PCR thực hiện trên mẫu ối tươi và ối nuôi cấy cũng (SEA deletion) in Southeast Asian populations and ap- cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với phương pháp plication to accurate prenatal diagnosis of Hb Bart’s lai phân tử ngược trên mẫu ối nuôi cấy. Một số nghiên hydrops fetalis syndrome. Journal of Human Genetics. cứu cũng cho thấy giá trị của phương pháp PCR trong 2017; 62(8): 747-754. chẩn đoán trước sinh hội chứng Hb Bart’s [7,8]. Nghiên 8. Karnpean, R., et al. Accurate Prenatal Diagnosis of cứu này bước đầu cho thấy ưu điểm của việc sử dụng kỹ Hb Bart’s Hydrops Fetalis in Daily Practice with a Dou- thuật PCR trong chẩn đoán trước sinh ở những đối tượng ble-Check PCR System. Acta Haematol. 2009; 121(4): có nguy cơ sinh con bị Hb Bart’s, đặc biệt có thể thực 227-33. hiện trên mẫu ối tươi không cần nuôi cấy tế bào (nồng độ thấp nhất chúng tôi làm trong nghiên cứu này là 2,5 ng/ µl). Phát hiện đột biến --SEA từ mẫu ối không cần nuôi cấy bằng phương pháp PCR cho kết quả sớm trong vòng 24 giờ sau khi nhận mẫu, là ưu điểm thiết yếu trong chẩn đoán di truyền trước sinh. 5. KẾT LUẬN Thiết kế mồi đã khuếch đại thành công được đột biến mất đoạn --SEA. Phương pháp PCR phát hiện đột biến --SEA cho kết quả chính xác, nhanh chóng, kỹ thuật đơn giản, hiệu quả về chi phí, và có độ nhạy, độ đặc hiệu là 100% khi so với phương pháp lai phân tử ngược. Kỹ thuật này cho thấy tiềm năng phát hiện đột biến trên cả mẫu tế bào ối không cần thời gian nuôi cấy trong chẩn đoán trước sinh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Weatherall, D.J. Thalassemia as a global health prob- lem: recent progress toward its control in the developing countries. Ann N Y Acad Sci. 2010; 1202: 17-23. 2. Bui Thi Kim L., D. Phu Chi, C. Hoang Thanh. Spectrum of Common alpha-Globin Deletion Mutations in the Southern Region of Vietnam. Hemoglobin. 2016; 40(3): 206-7. 3. Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Hương Ly, Lê Phương Thảo, Trần Danh Cường. Đặc điểm đột biến gen globin của những đối tượng nguy cơ cao sinh con mắc thalassemia tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2018. Tạp chí Phụ sản. 2019; 16(3): 22-27. 4. Chong, S.S., et al. Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of α-thalassemia. Blood. 2000; 95(1): 360-362. 5. Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vân Anh, Lê Phương Thảo, Đoàn Thị Kim Phượng, Phan Thu Giang. Giá trị của MCV, MCH trong sàng lọc bệnh alpha-thalassemia của các thai phụ tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Tạp chí Phụ sản. 2019; 16(3): 28-34. 6. Liu, Y.T., et al. Rapid detection of alpha-thalassaemia deletions and alpha-globin gene triplication by multi- plex polymerase chain reactions. Br J Haematol. 2000; 108(2): 295-9. Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 31