Chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 12. Juan Tian., Guohua Yang et al<br /> (2011). Molecular diagnosis of two families<br /> <br /> with classic congenital adrenal hyperplasia,.<br /> Gene, 05.019, 368 - 389.<br /> <br /> Summary<br /> MUTATION AND CARRIER DETECTION OF CONGENITAL ADRENAL<br /> HYPERPLASIA CAUSED BY 21 - HYDROXYLASE DEFICIENCY<br /> Congenital adrenal hyperplasia causes by 21- hydroxylase deficiency (CAH - 21OH) is an<br /> autosomal recessive genetic disorder due to mutation in the CYP21A2 gene. The aim of this study<br /> was to identify mutations of CYP21A2 gene in patients with CAH - 21OH and detect the carrier in<br /> family members of CAH - 21OH patients. 33 CAH - 21OH patients and 78 family members were<br /> selected for this study; direct DNA sequencing and MLPA were used to identify the mutation and<br /> carriers in CYP21A2. The result showed that, in the patient group, 33/33 (100%) patients were<br /> found to have mutation in CYP21A2 gene with 7 different types of mutation and 656 A/C > G<br /> (IVS2 - 13A/C > G) was the most common mutation with 13/33 (39.5%) and following is the<br /> deletion mutation with 7/33 (21.2%). In the carrier group, 32/33 fathers, 33/33 mother and 5/12<br /> siblings were identified as carrier. Our results are important for prenatal diagnosis and genetic<br /> counseling to reduce the ratio of disease and have suitable treatment for mother in initial weeks of<br /> gestation.<br /> Keywords: congenital adrenal hyperplasia, CYP21A2 mutation, carrier<br /> <br /> CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN<br /> BẨM SINH THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE<br /> Ngô Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Phú Đạt1,<br /> Nguyễn Viết Tiến2, Tạ Thành Văn1<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương<br /> <br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, khoảng<br /> trên 90% gây nên do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase. Việc đưa ra một phác đồ điều trị thích hợp với các bà<br /> mẹ mang thai sẽ là giải pháp hiệu quả để để tránh được hiện tượng nam hóa đối với trẻ gái bị bệnh. Nghiên<br /> cứu này được tiến hành với mục tiêu chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ mang gen đột biến dị hợp tử<br /> bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA để xác<br /> định đột biến gen ở thai nhi tuần thứ 16 của 04 thai phụ thuộc 04 gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận<br /> bẩm sinh. Kết quả cho thấy, 1 thai nhi mang đột biến dị hợp tử 656A/C > G/1763insT, 1 thai nhi mang đột<br /> biến đồng hợp tử 2110C > T (R356W) và 2 thai nhi không mang gen đột biến gen.<br /> Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, chẩn đoán trước sinh, đột biến gen CYP21A2<br /> <br /> 194<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh (congenital<br /> adrenal hyperplasia - TSTTBS) thể thiếu<br /> enzym 21 - hydroxylase (21 - OH) là bệnh di<br /> truyền lặn trên nhiễm sắc thể số 6. Bệnh do<br /> đột biến gen CYP21A2 gây rối loạn quá trình<br /> sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận, bệnh<br /> cảnh lâm sàng là cơn suy thượng thận cấp<br /> hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ<br /> trai [1, 2].<br /> Bệnh có thể dự phòng bằng phương pháp<br /> tư vấn di truyền dựa trên kết quả phát hiện<br /> người lành mang gen bệnh và chẩn đoán<br /> trước sinh. Theo nghiên cứu của Lee và cộng<br /> sự, ước tính tỷ lệ người lành mang gen bệnh<br /> tăng sản thượng thận bẩm sinh là 1/83 đối với<br /> quần thể người Trung Quốc [3]. Theo các báo<br /> cáo khác trên thế giới, tỷ lệ chung người lành<br /> mang gen bệnh là 1/55 [4, 5]. Ở Việt Nam,<br /> khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, bệnh<br /> viện Nhi Trung ương là một trong những nơi<br /> quản lý số lượng lớn khoảng trên 600 bệnh<br /> nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. Tuy<br /> nhiên, việc phát hiện, quản lý chưa được thực<br /> hiện thường quy, mặc dù công việc này là cần<br /> thiết nhằm: 1. Chẩn đoán và điều trị trước sinh<br /> cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng và làm<br /> giảm nam hóa gây mơ hồ giới tính sau sinh và<br /> điều trị sớm ngay sau sinh cho thai nhi trai. 2.<br /> Tư vấn tiền hôn nhân nhằm giảm trẻ sinh ra bị<br /> mắc bệnh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên,<br /> đề tài được thực hiện với mục tiêu chẩn đoán<br /> trước sinh cho các thai phụ mang gen đột biến<br /> dị hợp tử bệnh tăng sản thượng thận bẩm<br /> sinh thể thiếu 21 - OH.<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn - Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Số 1 Tôn Thất Tùng, Đống Đa, Hà Nội.<br /> Email: tathanhvan@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 04/03/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 26/4/2013<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> 4 thai phụ của 4 gia đình có con bị bệnh<br /> tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu<br /> enzym 21 - hydroxylase đã xác định được đột<br /> biến, đang mang thai ở tuần thứ 16.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Quy trình lấy mẫu<br /> Các thai phụ mang gen dị hợp tử đã có<br /> con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh<br /> thể thiếu 21 - OH được kiểm tra bằng siêu âm<br /> và đo nồng độ HCG trong huyết thanh. Lấy<br /> mẫu bằng phương pháp chọc hút dịch ối dưới<br /> sự hướng dẫn của siêu âm tại bệnh viện Phụ<br /> Sản trung ương. Dịch ối được bảo quản và<br /> vận chuyển về trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, trường Đại học Y Hà Nội.<br /> 2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA<br /> DNA được tách chiết từ tế bào ối theo quy<br /> trình phenol/chloroform. Tất cả các mẫu DNA<br /> được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch,<br /> những mẫu có OD 260 - 280 đạt từ 1,8 - 2<br /> được sử dụng để phân tích gen.<br /> 2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen<br /> Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để<br /> khuyếch đại gen CYP21A2. Chu trình nhiệt<br /> phản ứng PCR: 900C - 10 giây, [960 C - 10<br /> giây, 550C - 15 giây, 720C - 2 phút] x 30 chu kỳ.<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải<br /> trình tự trên máy ABI - 3100 tại trung tâm<br /> nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y<br /> Hà Nội. Kết quả được phân tích bằng phần<br /> mềm CLC và so sánh với kết quả của bệnh<br /> nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh trong gia<br /> đình đã xác định được đột biến.<br /> 2.3. Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation<br /> dependent probe amplification)<br /> Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland)<br /> 195<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh<br /> nhân và người lành mang gen bệnh. Thành<br /> phần của kit gồm các probe để khuyếch đại<br /> gen CYP21A2, mỗi probe tương ứng với một<br /> vùng gen, ngoài ra còn có các probe đặc<br /> trưng cho gen của người cũng được sử dụng<br /> để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc<br /> thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm<br /> khuếch đại được điện di mao quản trên máy<br /> <br /> giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại<br /> của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của<br /> đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Bằng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA,<br /> đã phát hiện được 2/4 thai nhi không có đột<br /> biến gen CYP21A2, 2/4 thai nhi có đột biến<br /> gen giống anh trai của thai nhi (bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả phân tích gen của thai nhi và gia đình<br /> Gia đình<br /> <br /> Bệnh nhân<br /> <br /> Bố bệnh nhân<br /> <br /> Mẹ bệnh nhân<br /> <br /> Thai nhi<br /> <br /> Gia đình 1<br /> <br /> 656A/C > G/656A/C ><br /> G** (anh trai)<br /> <br /> 656A/C > G*<br /> <br /> 656A/C > G*<br /> <br /> Gia đình 2<br /> <br /> 656A/C > G<br /> * /1763insT* (anh trai)<br /> <br /> 656A/C > G*<br /> <br /> 1763insT*<br /> <br /> 656A/C ><br /> G/1763insT*/*<br /> <br /> Gia đình 3<br /> <br /> 2110C > T/2110C ><br /> T** (anh trai)<br /> <br /> 2110C > T*<br /> <br /> 2110C > T*<br /> <br /> 2110C ><br /> T/2110C>T**<br /> <br /> Gia đình 4<br /> <br /> exon 1 - 3 del/exon 1 3 del** (chị gái)<br /> <br /> exon 1 - 3 del*<br /> <br /> exon 1 - 3 del*<br /> <br /> Bình thường<br /> <br /> Bình thường<br /> <br /> ** Đột biến đồng hợp tử; * Đột biến di hợp tử<br /> Kết quả ở bảng 1 cho thấy bố và mẹ đều mang gen ở trạng thái dị hợp tử, bệnh nhân và 2 thai<br /> nhi có đột biến gen đều nhận 2 allele đột biến từ bố và mẹ.<br /> Kết quả đột biến gen của phả hệ gia đình 3<br /> Gia đình này có người con trai bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được phân tích xác<br /> định đột biến gen CYP21A2. Kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến 2110C > T ở trạng thái<br /> đồng hợp tử. Kết quả phân tích gen trên bố, mẹ bệnh nhân cho thấy đều mang gen dị hợp tử<br /> 2110C > T (người lành mang gen bệnh). Bà mẹ mang thai được chẩn đoán trước sinh ở tuần thứ<br /> 16. Kết quả cho thấy thai nhi bị đột biến gen giống như người anh trai (hình 1).<br /> <br /> 196<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> III<br /> Nữ bình thường<br /> <br /> Nam bình thường<br /> <br /> Nữ mang gen<br /> <br /> Nam mang gen<br /> <br /> Thai nhi bị bệnh<br /> 2110C<br /> <br /> Người bình thường<br /> 2110C>T<br /> R 356 W<br /> <br /> Bố bệnh nhân<br /> <br /> Nam bị bệnh<br /> 2110C>T<br /> R 356 W<br /> <br /> Bệnh nhân<br /> 2110C>T<br /> R 356 W<br /> <br /> Mẹ bệnh nhân<br /> <br /> 2110C>T<br /> R 356 W<br /> <br /> Thai nhi<br /> <br /> Hình 1. Kết quả chẩn đoán trước sinh gia đình 3<br /> A) Phả hệ gia đình bệnh nhân; B) Kết quả phân tích gen CYP21A2. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị<br /> trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid.<br /> Kết quả đột biến gen của phả hệ gia đình 4<br /> Gia đình này có con gái bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được phân tích xác định đột<br /> biến gen CYP21A2. Kết quả cho thấy, bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử mất đoạn exon 1 - 3.<br /> Kết quả phân tích gen trên bố, mẹ bệnh nhân cho thấy họ đều mang gen dị hợp tử mất đoạn<br /> exon 1 - 3 (người lành mang gen bệnh). Bà mẹ mang thai được chẩn đoán trước sinh ở tuần thứ<br /> 16. Kết quả cho thấy thai nhi không có đột biến gen giống như người chị gái (hình 2).<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> 197<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> III<br /> Nữ bình thường<br /> <br /> Nam bình thường<br /> <br /> Nữ mang gen<br /> <br /> Nam mang gen<br /> <br /> Thai nhi bình<br /> thường<br /> <br /> ex3<br /> <br /> Nam bị bệnh<br /> <br /> ex1<br /> Y<br /> Người bình thường<br /> <br /> ex3<br /> <br /> ex1<br /> <br /> ex3<br /> <br /> ex1<br /> <br /> ex3<br /> <br /> ex1<br /> <br /> Y<br /> Bệnh nhân<br /> <br /> Y<br /> <br /> Y<br /> ex3<br /> <br /> Bố bệnh nhân<br /> <br /> Mẹ bệnh nhân<br /> <br /> ex1<br /> Y<br /> <br /> Thai nhi<br /> <br /> Hình 2. Kết quả chẩn đoán trước sinh gia đình 4<br /> <br /> A) Phả hệ gia đình bệnh nhân; B) Kết quả phân tích gen CYP21A2. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị<br /> trí đột biến, ex1, ex3, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3 của gen CYP21A2; Y là đỉnh<br /> tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính.<br /> <br /> 198<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br />